1. 引言

多肽作为生物制药、诊断试剂和功能研究的重要分子，其纯化效率直接影响下游应用效果。反相高效液相色谱（RP-HPLC/RPLC）因其高分辨率、重现性和灵活性，成为多肽分离的首选技术。固定相（色谱填料）的选择是多肽分离的核心，需综合考虑多肽性质、分离目标及工艺效率。

2. 反相色谱分离多肽的基本原理

反相色谱通过多肽与固定相之间的疏水相互作用实现分离。固定相表面键合的非极性官能团（如C18、C8）与多肽的疏水区域结合，流动相中有机溶剂（乙腈、甲醇）梯度增加时，疏水性较弱的多肽先被洗脱，疏水性强的多肽保留更久。分离效率取决于：

固定相化学性质（键合相类型、碳载量、封端处理）

物理结构（粒径、孔径、比表面积）

多肽特性（疏水性、电荷、分子量、二级结构）

3. 反相固定相的关键选择参数

3.1 键合相类型

C18（十八烷基）：

高疏水性，适合长链、疏水性强的多肽（如富含Leu、Ile、Phe、Val、十八烷二酸或二十烷二酸等）。高碳载量提供强保留，但可能导致疏水性强肽的洗脱困难，需高有机相比例。当载样量较大或是所选的流动相体系对该样品溶解性差时可能因样品保留太强导致样品洗脱不完全，需多次冲柱，为避免此类现象发生可选择C8或是C4等保留较差一点的键合相。

C8（辛基）：

中等疏水性，适合中等疏水性多肽或需缩短分离时间的场景。

对极性多肽保留较弱，可减少有机溶剂消耗。

C4（丁基）：

低疏水性，适用于短肽、亲水性多肽或易聚集的疏水多肽（如跨膜肽）。

减少强疏水相互作用，降低变性风险。

苯基/极性嵌入相：

通过π-π作用或极性基团增强对含芳香族残基或多肽构象的选择性。

选择策略：

多肽疏水性（可通过软件预测或实际测试）决定键合相疏水强度。

若目标多肽疏水性差异小，优先选择C18以提高分辨率；若需快速洗脱，选择C8或C4。

3.2 粒径与柱效

小粒径（1.7–3 μm）：

高柱效（理论塔板数高），适合复杂样品的高分辨率分离。

需配合超高效液相色谱（UHPLC）系统以承受高背压。

大粒径（5–10 μm）：

低背压，适合常规HPLC系统或制备级纯化。

核壳（表面多孔）颗粒：

平衡柱效与背压，适合快速分析（如2.7 μm核壳颗粒）。

3.3 孔径与多肽尺寸

大孔径（300 Å）：

适合大分子多肽（>5 kDa）或易形成聚集体，确保传质充分。

小孔径（100–120 Å）：

适合小肽（<5 kDa），提供更大的比表面积以增强保留。如肽序很亲水固定相不易保留建议选择100 Å

3.4 封端处理与表面化学

封端处理：减少未键合硅羟基的残留，降低多肽与固定相的次级相互作用（如离子交换），改善峰形。如裸露氨基较多的建议选择封端效果较好的固定相。

杂化颗粒：提升pH耐受性（pH 1–12），适合极端pH条件（如酸性流动相抑制多肽电离）。

4. 快速分离的优化策略

梯度斜率优化：

增加梯度斜率（如3%乙腈/min→5%乙腈/min）可缩短运行时间，但需平衡分辨率。

使用短柱（50–100 mm）配合小粒径填料，加快洗脱。

温度控制：

升高柱温（40–60℃）可降低流动相粘度，提高传质速率，减少分析时间。

表面修饰技术：

选择具有极性嵌入基团（如酰胺）的固定相，减少疏水塌陷风险，允许低有机相起始比例，缩短梯度时间。

5. 结论

反相固定相的选择需系统分析多肽特性（疏水性、分子量、稳定性）与分离目标（分析/制备、速度/分辨率）。通过结合键合相类型、粒径、孔径的优化，并调整梯度条件与温度，可实现多肽的高效纯化。未来发展趋势包括新型杂化材料、单克隆抗体修饰固定相以及人工智能辅助填料设计。