小伙伴们做液相实验的时候是不是总会用到各种压力问题和基线问题，高了，低了，堵了，漏了，飘了。。。。。我们来看看导致这些问题的原因吧，从根源上破，so easy！

液相色谱压力异常

液相系统压力产生的原因在于流动相流经管路及色谱柱时会有阻力，即所谓的反压或系统压力。漏液会引起系统压力的降低，而堵塞会引起系统压力的飙升。

系统压力的单位有：巴（Bar）、兆帕（Mpa）和磅／平方英吋（psi），它们之间的换算关系为１Bar＝0.1Mpa＝14.5psi。

１、影响因素

影响系统压力的因素主要有流动相的溶剂组成、温度及流速这三方面：

（1）流动相的粘度是产生反压的主要原因，下图为有机溶剂－水的粘度随组成与压力的关系图：

由上图可以看到，乙腈－水比例为（20:80）、甲醇－水比例为（40:60至50:50）时，系统的压力最大。因此，在做实验时应尽量避开这个比例范围。另外，异丙醇粘度大，一般不作流动相使用。

（2）流速对反压的影响是线性关系，流速增加，反压亦增大。

（3）温度对反压的影响是反比关系，温度升高，反压降低，对某些流动相的影响更大一些。

（4）液相色谱仪各模块之间的连接管路也会产生压力，系统压力与管路的长度成正比，与管路直径的四次方成反比（1/4D）。

上述考虑的是柱外因素对系统压力的影响，色谱柱对系统压力的影响也很大，反压与色谱柱长度成正比，与填料颗粒度的平方成反比（2.5μｍ填料比3.5μｍ填料反压高）。

２、压力原因

具体到压力问题的表现形式上，主要有压力高、压力低或没有压力以及压力不稳：

造成压力高问题的主要原因有：

（1）温度太低；

（2）流速太高；

（3）流动相粘度大；

（4）管路堵塞；

（5）仪器或色谱柱堵塞；

（6）压力传感器问题。

系统压力高的故障排除流程图如下：

产生压力低情况的可能原因：

（1）系统内有渗漏处；

（2）单向阀堵塞；

（3）入口管路有气泡；

（4）溶剂滤头堵塞；

（5）所用溶剂不正确，储液瓶中无溶剂；

（6）温度太高，流速太低；

（7）泵未输送流动相；

（8）泵关闭或保险丝断了。

以上为仪器单向阀的结构示意图，如果某些原因造成宝石球与球基座发生黏结，造成液体不能进入到泵中，从而造成泵的压力偏低。

３、造成压力波动可能的原因有：

（1）脱气机排气不充分；

（2）流动相未正确脱气；

（3）所用溶剂不混溶或易挥发；

（4）压力传感器及泵问题。

其中，大多数的压力波动都是由于气泡引起的（如下图）：

基线噪音问题

１、基线噪音大

（1）流动相中有气体–溶剂脱气；

（2）流动池中有气泡–在出口处使用0.009”的管路；

（3）色谱柱上的污染物被洗脱–平衡系统，直至基线稳定；如样品中有保留非常强的组分，可设置强洗脱程序；

（4）渗漏–此时应修复渗漏，重新连接或更换接头；

（5）检测器灯能量低–更换灯；

（6）灵敏度太高–使用合适的采样频率，调节增益（如ELSD检测器）；

７）检测器流动池脏–清洁流动池；

（8）电噪音–除去电噪音的来源：屏蔽电缆，清洁触点；

（9）采样频率设置过大–一味追求高采样频率，可能对灵敏度没有任何帮助，同时也会产生比较大的噪音：UV检测器推荐降低采样频率，HPLC推荐1-5Hz，UPLC推荐20Hz。

2、同步的基线噪音

（1）大多数情况下都是泵引起的，泵头中存在空气–将溶剂脱气，并重新灌注泵；

（2）单向阀问题–超声清洗单向阀或更换；

（3）柱塞杆断裂–更换；

（4）混合问题–更换一个体积更大的Mixer，以增加系统体积；

（5）电噪音–改变电路，除去来源。

３、不同步的基线噪音

（1）气泡—流动相要脱气；

（2）检测器中有气泡／空气—流动相脱气，或在检测器的后面加反压（不适用于RI检测器）；

（3）渗漏—特别是肉眼无法发现的微漏或者泵的内漏，会造成流速的变化和混合比例的变化，从而导致基线噪音，此时应修复渗漏，重新连接或更换接头；

（4）管路堵塞—除去堵塞，冲洗系统；

（5）电噪音—除去来源，改变电路。

４、基线漂移：上漂或者下漂

（1）梯度变化引起，如溶剂Ｂ的吸收值高于溶剂Ａ–使用基线差减，或尝试新的流动相；

（2）化合物从色谱柱上洗脱–平衡系统，直至基线稳定；如样品中有保留非常强的组分，可设置强洗脱程序；

（3）溶剂改变（气体吸附，蒸发）–氦气脱气，隔离溶剂；

（4）溶剂渗漏–拧紧或者更换接头；

（5）检测器温度影响（尤其是示差，电化学以及电导检测器）–流动池温度调节；

（6）柱温波动–等待柱温平稳，使用柱预加热器；

（7）压力变化–过滤溶剂以及样品，或样品太粘稠；

（8）混合问题–更换一个体积更大的Mixer，以增加系统体积。

５、Cyclic基线

（1）温度影响–隔离热源，或搬离临近的通风口，或增加流动池温度；

（2）混合问题–更换一个体积更大的Mixer，以增加系统体积；

（3）流动相中的气体–溶剂脱气；

（4）泵不稳定–检查维修泵；

（5）管路堵塞–冲洗系统，排除并除去堵塞源头；

（6）电问题–改变电路，或除去根源。

６、基线上的毛刺

（1）气泡–溶剂脱气，并重新灌注泵，流动相脱气越好，基线就会越好；

（2）信号连接不好，连线变松–清洁并拧紧检测器上的导线，或检查连线是否有损坏，或更换铲形接线片；

（3）灯继电器试图点燃熄灭的灯–更换灯；

（4）电噪音–更换电路，或除去根源。

７、小结

（1）确保无电源及电噪音干扰；

（2）为避免基线噪音，确保仪器系统内无气泡或空气，流动相首选过滤脱气；排尽管路、进样器、检测池中的气泡；选择合适的接头和管路，防止渗漏；

（3）在编辑方法时，针对HPLC和UPLC仪器UV检测器设置合适的采样频率，HPLC推荐1-5Hz，UPLC推荐20Hz；

（4）保持良好的操作习惯，如UPLC仪器水相流动相每天更换，添加了缓冲盐的流动相过0.2μｍ溶剂过滤膜等，都会减小基线噪音的产生。