摘 要 / Abstract
流感病毒感染在世界范围内引起较高的发病率和死亡率。接种流感疫苗是预防和控制流感病毒感染及其严重并发症的有效手段，但由于流感病毒抗原的变异性，导致疫苗毒株与当年的流行毒株的抗原性并不完全匹配，造成流感疫苗的有效性降低，不能有效预防季节性和大流行流感，因此研发通用疫苗成为当前的主要趋势。本文综述了流感疫苗的发展及通用流感疫苗的研发平台，为未来新型流感疫苗的设计和开发提供参考。
Influenza virus infections cause significant morbidity and mortality worldwide. Vaccination against influenza is an effective measure for preventing and controlling influenza virus infections and their serious complications. However, due to the antigenic diversity and variability of the influenza virus, the antigenicity of vaccine strains may not fully match the circulating strains, which leads to lower effectiveness of influenza vaccines in preventing seasonal and novel pandemic influenza. Therefore, developing universal influenza vaccine has become an urgent task. This paper reviews the development of influenza vaccines and the research and development platform for universal influenza vaccines, aiming to provide insights for the design and development of novel influenza vaccines.
关 键 词 / Key words：流感病毒；疫苗；通用流感疫苗；研发平台
influenza virus; vaccine; universal influenza vaccine; research and development platform
流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，造成严重的疾病负担。据世界卫生组织（WHO）报告，流感每年可导致5%~10% 的成人和20%~30%的儿童发病，全球每年约有10 亿人感染，其中导致的重症病例为300 万~500 万例，相关死亡病例为29 万~65 万例[1]。接种流感疫苗是预防和控制流感病毒感染及其严重并发症的最有效手段。自1973 年以来，WHO 根据全球监测系统和对最有可能传播的流感毒株的预测，发布关于流感疫苗组分的建议；自1999 年以来，每年分别就北半球和南半球提出疫苗组分建议[2]。然而，因为流感病毒血凝素发生抗原漂移和（或）抗原转换[3]，导致疫苗毒株与流行毒株的抗原性并不完全匹配，致使流感疫苗的有效性降低。全球科学家和各国卫生组织将目标投向开发通用流感疫苗计划[4-5]，以降低流感的发病率和死亡率。本文就流感疫苗的发展以及通用流感疫苗的研发平台进行综述，旨在为未来新型流感疫苗的设计和开发提供参考。
1、流感病毒与流感疫苗发展概况
流感病毒根据核蛋白和基质蛋白不同，主要分为甲（A）、乙（B）、丙（C）型，均可感染人类。2011 年，美国科学家从猪中分离出一种新的流感病毒[6]；2016 年，国际病毒分类委员会执委会命名该新病毒为D 型流感病毒，目前D 型流感病毒主要存在牛、猪等动物中，但尚无直接证据表明其可以感染人类[7-8]。
1918 年的“西班牙流感”是人类历史中已知且有翔实记录的最为严重的流感大流行，但直到1933 年才首次分离到甲型流感病毒——A（H1N1） 亚型。20 世纪30 年代中期，研发出了第一种流感疫苗，即用鸡胚生产的灭活甲型流感疫苗；1940 年，分离到B 型流感病毒；1942 年， 成功研发了包括A（H1N1）亚型和B 型流感病毒在内的二价灭活流感疫苗。1968 年，甲型流感病毒H3N2 大流行，提出了三价灭活流感疫苗的需求；同年，裂解疫苗（反应性比全病毒疫苗小，尤其适用于儿童）在美国获得授权。通过基因重配可以筛选得到高产病毒株，基因重配技术使流感疫苗毒株在鸡胚中生长更快。1976~1977 年， 在裂解疫苗的基础上，具有高度免疫原性的血凝素（HA） 和神经氨酸酶（NA）抗原被提取、纯化，成功研制成亚单位疫苗，于1980 年在英国首先获批。1978 年，三价灭活流感疫苗在美国批准上市[2]。2000年后，佐剂疫苗（铝佐剂和水包油佐剂MF59、AS03）、高剂量疫苗Fluzone 相继开发。美国食品药品监督管理局（FDA）于2012 年和2013 年分别批准四价流感裂解疫苗Fluarix 和重组蛋白三价流感疫苗FluBlock[9]。病毒样颗粒、多肽疫苗、病毒载体疫苗、核酸疫苗等新一代流感疫苗正在研发中[10]。
2、目前上市的流感疫苗及使用情况
2.1 国内外上市的流感疫苗
目前全球上市的流感疫苗包括灭活流感疫苗（inactivatedinfluenza vaccines，IIV）、减毒活流感疫苗（live attenuatedinfluenza vaccines，LAIV）和重组流感疫苗（recombinantinfluenza vaccines，RIV）3 种类型[11]。中国批准上市的流感疫苗包括三价灭活流感疫苗（IIV3）、四价灭活流感疫苗（IIV4）和三价减毒活流感疫苗（LAIV3）[12]，我国疫苗企业也正在开发重组蛋白流感疫苗。
灭活流感疫苗包括全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗。由于灭活疫苗临床安全性高和免疫效果较好，且生产成本低，使其成为最常见的流感疫苗。减毒活流感疫苗具有能激发黏膜、全身体液免疫反应和细胞免疫反应的优点， 尤其儿童免疫后能形成长期的免疫记忆[13-14]。美国Protein Sciences 公司（2017年被赛诺菲巴斯德公司收购）开发的一款基于昆虫杆状病毒表达系统的重组蛋白技术的流感疫苗FluBlock，在生产速度、可扩展性、生物安全性和灵活性以及疫苗中HA 的可靠性等方面，与基于鸡胚和细胞的平台相比具有一定的优势[15-16]。流感疫苗接种后免疫力的存在和减弱速度的数据各不相同，与流感季节开始时间、免疫力下降速度和疫苗有效性差异相关，因而WHO 和各国推荐所有≥ 6 个月且无禁忌症的人群应每年接种流感疫苗。
2.2 流感疫苗使用及有效性
目前针对3 岁以上人群的三价、四价灭活流感疫苗制剂每剂含有15μg HA ；对于6~36 个月的儿童，HA 浓度为7.5μg/ 剂或15μg/ 剂；2009 年以来开发的含60μg/ 剂的高剂量HA 灭活流感疫苗主要用于65 岁或以上的人群[17-18]。免疫功能低下的人群可建议使用佐剂疫苗[19]。
2003 年， 基于不同减毒亚型的三价减毒活流感疫苗在美国获得许可，用于2~49 岁的人群。减毒活流感疫苗于2012 年改为四价制剂， 现在已获准在美国（2~49 岁）、加拿大（2~59 岁）、欧盟和英国（2~17 岁）相关人群使用[20]。
2013 年，美国FDA 批准重组流感疫苗上市，含有45μg/ 剂rHA 的重组流感疫苗用于18 岁以上人群[21]。
欧洲和美国等发达国家和地区的流感疫苗接种覆盖率超过50%[22-23]。中国总体流感疫苗接种率仅为2.4%，其中40~59 岁年龄组的接种率为1.7%，60 岁及以上年龄组为3.8%[24] ；将儿童也纳入统计结果，2004~2014年全国平均流感疫苗接种率仅为1.5%~2.2%[25]。流感疫苗在不同季节和不同人群中的有效性和效力存在相当大的变异性，美国2009~2010 年流感季节至2019~2020 年流感季节的流感疫苗有效性介于19%~60%，通常当A（H3N2）为优势株时，流感疫苗有效性较低[26]。以鸡胚为基础的灭活疫苗是最常用的，但因鸡胚适应性突变导致有效性降低，使用哺乳动物（犬肾细胞）或昆虫（重组杆状病毒）细胞系生产的基于细胞的流感疫苗能提升疫苗毒株与流行毒株之间抗原匹配度[27]。与其他流感疫苗制剂相比，四价重组流感疫苗（RIV4）对免疫功能低下的人群（如老年人和高危人群）更为有效[28-29]。
3、通用流感疫苗研发平台
流感病毒的抗原漂移和抗原转换使其能够逃避抗体中和[3]，进而突破自然感染和疫苗接种诱导的群体免疫[30]，且流感病毒的这些变异是不可预测的，因此流感的防控工作对全世界的研究者具有非常大的挑战性。为了克服现有流感疫苗的局限性，迫切需要一种能够提供长期和广谱保护作用的通用流感疫苗。理想的通用流感疫苗应对所有流感病毒（主要是A、B 型流感病毒）、各种HA 和NA 亚型或潜在的抗原突变有效[4]。为了实现这一目标，通用流感疫苗应能够诱导交叉保护性抗体，通常通过靶向HA、NA或M2 中发现的保守表位或内部蛋白质（如M1 和NP）诱导的细胞免疫反应来设计[31-33]。
3.1 基于HA 设计的通用流感疫苗
HA 介导病毒附着在唾液酸化的宿主细胞受体上，在感染过程中通过与膜的融合进入，其包括球状头部结构域和茎部结构域，HA 诱导的特异性抗体具有中和作用。HA 的高糖基化降低了对头部结构域的免疫应答，较低的免疫压力使HA 茎部结构域与头部结构域相比相对保守。目前基于HA 的通用流感疫苗研发策略主要有：保持HA 完整结构，但毒株特异性的HA 头部使用另一种更为保守的HA 头部替换，从而开发出一种新的嵌合HA 疫苗；或者去除头部结构，仅保留具有免疫原性的茎部；基于计算优化的广谱反应性抗原的HA 茎部和头部诱导特异性交叉反应抗体[34]等。根据HA 的不同结构域，已经开发了一些基于HA 的疫苗设计，临床前研究和临床试验研究正在开展中[35]。
3.2 基于NA 设计的通用流感疫苗
NA 是流感病毒表面的四聚体糖蛋白，在病毒复制中起关键作用，中等程度保守，其诱导产生中和抗体限制病毒在宿主体内传播，奥司他韦、帕拉米韦和扎那米韦等抗病毒药物靶向NA，对A、B 型流感病毒均有效[36]。研究者用麻疹病毒磷蛋白的四聚体结构域替换NA 的细胞质区、跨膜区和茎区，设计重组NA 候选疫苗N1-MPP，在小鼠模型上对致死性攻击显示了强有力的保护，这种重组NA 候选疫苗可以增强对季节性流感病毒的保护[37]。Skarlupka 等人使用计算优化的广谱反应性抗原方法设计的含有4 种甲型流感病毒NA 活性的N1疫苗抗原免疫小鼠，受致死性攻击后小鼠肺病毒滴度低，所有小鼠存活；该疫苗诱导产生的NA抗体能与N1 亚型的禽流感、猪流感和人流感病毒发生交叉反应，并具有中和活性[38]。
3.3 基于M2e 设计的通用流感疫苗
流感病毒M2e 蛋白诱导的特异性中和抗体可以通过补体或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性与病毒感染宿主细胞上表达的M2e结合。M2e 蛋白高度保守使其作为通用流感疫苗的重要靶标，但流感病毒感染或疫苗接种后，针对M2e 的免疫应答较弱，可能是由于抗HA 抗体的空间位阻限制了M2e进入免疫系统发挥作用[39]。M2e 的轻度免疫力对开发有效流感疫苗构成了障碍，可以通过载体或佐剂来改进M2e 疫苗[35]。另外， 设计M2e 联合HA、NA 的嵌合疫苗能够大大提高疫苗的保护作用[40-41]。
3.4 基于病毒内部蛋白设计的通用流感疫苗
流感病毒核蛋白（NP）与聚合酶复合物（PB1、PB2 和PA蛋白）一起形成核糖核蛋白复合物，对于病毒复制和转录至关重要[42]。由于序列保守和广泛的NP 特异性免疫，使NP 成为通用流感疫苗开发的靶点。对基于NP的流感疫苗——OVX836 的动物模型表明，能诱导产生大量NP特异性肺CD8+ 组织驻留记忆性T 细胞，用于长期抗流感病毒[43]；另外临床研究表明，其具有安全性和反应原性，并具有体液免疫反应和细胞免疫反应[44]。流感内部蛋白可被抗原特异性CD8+ 和CD4+T 细胞靶向识别，在动物模型上诱导的病毒特异性T 淋巴细胞表现为明显的交叉免疫[45-46]。
新一代疫苗的创新平台结合通用流感疫苗设计，可以激发比传统流感疫苗更好的免疫反应[33]。mRNA 疫苗是一种易于操纵抗原的创新工具，并且有可能对新出现的疫情做出快速反应，其已经在新型冠状病毒感染大流行中显示出非常高的功效， 在建立mRNA 流感疫苗模型中可以显著减轻流感负担[47] ；病毒样颗粒能以自然构象呈递抗原，从而产生更好的免疫反应，M2 蛋白-NA和IL-12 组成的嵌合细胞因子的病毒样颗粒通用流感疫苗，成功诱导了针对A 型流感病毒同源和异源亚型感染的有效交叉保护反应[48]。纳米颗粒是高密度表达抗原并提供佐剂样功能的呈递平台，基于蛋白纳米颗粒介导的重组流感血凝素递送能够增强免疫原性、抗体反应的广度，并且维持Th1和Th2 平衡[49]。病毒载体疫苗能够诱导针对免疫原性蛋白的强烈体液和细胞适应性免疫应答，可通过全身或黏膜途径递送。研究者构建人H2 流感的腺病毒载体疫苗能增强同源和异源毒株的免疫能力[50]。另有研究表明， 基于腺病毒载体的多表位疫苗能对H5、H7 和H9 禽流感病毒产生交叉保护作用[51]。
4、挑战与展望
流感疫苗开发面临的巨大挑战是如何解决抗原变异株的频繁出现，以及流感病毒的快速变异率。这个至关重要问题的一个潜在解决办法是开发出具有最大保护作用的通用流感疫苗。各国研究者已经研制出多种针对流感病毒不同靶点的候选通用疫苗，在动物模型和临床阶段显示出良好的安全性和免疫原性，使得开发通用流感疫苗具有乐观的前景，但目前使用的中和抗体滴度来评估疫苗效力不足以评估通用流感疫苗的广度，需要加入细胞免疫和非中和抗体水平的保护相关性研究。因而，为实现通用流感疫苗批准上市的目标仍需要各国政府和社会组织投入大量的人力和资金进行科学研究，在此之前，进一步开发、优化工具预测流感病毒未来流行毒株仍然至关重要。
引用本文
汪立杰,黄维金,王佑春*.通用流感疫苗研发进展[J].中国食品药品监管,2023(05):18-23.
