在微生物学研究和工业生产中，甘油菌的保存与复苏扮演着关键角色。甘油作为一种广泛使用的保护剂，对于保持菌种的活性和稳定性至关重要。然而，保存和复苏过程中的精确操作和注意事项是决定菌种存活率和实验成功的关键因素。因此，对于科研和技术人员而言，熟知并遵循甘油菌种复苏与保存的正确流程和关键点是极其重要的。

具体来说，甘油菌种的保存一般通过低温冷冻实现。在这一过程中，将菌种与甘油按一定比例混合，并迅速降至-80℃或更低的温度，以确保菌种在低温条件下的长期稳定性。甘油的浓度、混合的均匀性以及冷冻的速度都是影响菌种保存效果的关键因素。

接下来，菌种的复苏过程也需要细致的操作。在复苏阶段，应该迅速将冷冻的菌种解冻，并在适宜的培养基中进行培养。在解冻过程中，温度和时间控制是至关重要的，因为解冻速度过快或过慢都可能对菌种造成损害。此外，复苏后的菌种应迅速转移到新鲜的培养基中，以促进其生长和活性的恢复。

在整个复苏和保存的过程中，无菌操作是必须严格遵守的，以防止外界污染对菌种造成不利影响。同时，定期对保存的菌种进行检查，确保其活性和纯度，这对于保障实验结果的可靠性至关重要。通过这些细致的操作和管理，可以最大限度地提高菌种的复苏成功率和实验的准确性。

1，菌种的保存与复苏

甘油菌种的复苏与保存是一个至关重要的流程，它包括几个关键步骤：

①菌种保存：

首先，将菌种接种到LB液体培养基中。

待菌体生长至对数生长期（培养体系内浑浊可见时）进行保存。

准备50%浓度的无菌甘油溶液，可以通过等体积的蒸馏水和甘油混合得到。

在无菌条件下，将菌液与甘油按1:1的比例混合，使最终甘油浓度达到25%。

将混合液转移至2ml离心管中，并在-20°C冰箱内保存。这种条件下，菌种的保存有效期为1年。若需长期保存，建议在-70°C或-80°C下冻存，保藏时间一般为2-4年。。

②菌种复苏：

在复苏阶段，将保存的菌种在30°C的水浴中快速解冻。

将解冻后，将菌液接种到固体培养基上，并在适宜条件下培养24-48小时，以恢复菌种的活性。。

③再次保存：

复苏后的菌种可以在新的液体培养基中继续培养。

为了长期保存，可以再次进行甘油保存。

在整个过程中，必须确保所有使用的工具和容器都经过适当的灭菌处理，以保持无菌条件，避免污染。正确的保存和复苏方法对于维持菌种的活性和纯度至关重要。保存温度对菌种的长期存活有显著影响，低温环境有利于延长菌种的保存时间。

2，复苏后的菌株活性判断

为了评估复苏后菌株的活性，可以采用以下方法进行综合判断：①菌落形态观察：检查菌落的形态、颜色和大小是否与原始菌株相符，形态正常的菌落通常表明菌株活性良好。②生长速度评估：观察复苏后的菌株在适宜培养基上的生长速度，生长速度符合预期通常意味着菌株活性正常；若生长缓慢或停滞，则可能指示菌株活性下降。③存活率评估：使用培养计数法，将复苏后的菌液稀释后接种到固体培养基上，经过一定时间培养，统计菌落数量，并据此计算存活率，高存活率通常表明菌株活性良好。④生化检测：通过检测菌株的代谢产物（例如酶活性、酸产量等）来评估其生理活性，代谢产物产量与预期相符通常意味着菌株活性良好。⑤分子生物学方法：利用RT-PCR或qPCR等技术检测关键基因的表达水平，基因表达水平正常通常指示菌株活性良好。⑥扩大培养：将复苏后的菌株进行扩大培养，并观察其在大规模培养条件下的表现，稳定的表现通常表明菌株活性良好。以上这些方法为评估复苏后菌株活性提供了一套全面的框架。针对特定菌株或实验需求，可以进一步细化和定制检测方法，以确保评估的准确性和菌株的稳定性。

3，菌种培养基类型

对于复苏后的菌株应根据其特性选择合适的培养基，常见的培养基如下，①营养肉汤/琼脂培养基（NA/NB）：适用于细菌的复苏和活化，尤其适合铜绿假单胞菌、沙门氏菌等。②脑心浸液肉汤/琼脂培养基（BHI）：由于其丰富的营养成分，适合营养需求较高的细菌。③MRS肉汤/琼脂：专为乳酸菌如乳杆菌、双歧杆菌等设计，以支持其生长。④2216E液体/琼脂培养基：适用于海生细菌，例如副溶血性弧菌、溶藻弧菌等。⑤沙氏葡萄糖液体/琼脂培养基：适用于真菌培养，例如酵母菌和霉菌等。⑥巧克力平板：专为嗜血杆菌、奈瑟氏菌等需要红细胞裂解释放的生长因子的细菌设计。⑦血平板：适合那些对营养有较高要求的细菌，包括链球菌、奈瑟氏菌、嗜血杆菌等。

在选择培养基时，应考虑以下关键因素以确保菌株的顺利生长和繁殖。①营养成分：确保培养基包含菌株所需的碳源、氮源和微量元素。②渗透压：通过适当的氯化钠浓度来维持培养基的渗透压，以适应菌株的生理需求。③pH值：使用磷酸盐等缓冲剂来保持培养基的pH值稳定，为菌株提供一个适宜的生长环境。④特殊成分：根据菌株的特定需求，添加血清、维生素等特殊成分。通过根据菌株的具体需求来选择适当的培养基，可以促进复苏后的菌株顺利生长和繁殖。如果存在特定的菌株或实验需求，可以进一步定制培养基的配方，以满足这些需求。

4，菌种纯度的判断

评估菌株纯度通常涉及以下步骤。①菌落形态观察：在适宜的培养基上，将待测培养物稀释并涂布或划线，培养后，检查同一平板上所有单菌落的一致性，包括大小、形状、颜色、质地和光泽，若发现形态各异的菌落，可能指示有污染存在。②细胞形态观察：对处于对数生长期的培养物进行革兰氏染色，在显微镜下观察细胞的形态、大小和荚膜等特征是否一致，细胞形态的不一致性可能暗示杂菌的存在。③生化检测：通过分析菌株的代谢产物（例如酶活性、酸产量等）来评估其纯度，代谢产物的异常产量可能表明杂菌的污染。④分子生物学方法：利用PCR等技术检测菌株中特定基因的存在，非目标基因的检测结果可能揭示杂菌的污染。⑤单菌落分离：对于那些在外观上难以判断纯度的菌株，可以通过单菌落分离技术来获取纯培养物，然后对这些分离的单菌落进行进一步的形态和生化特征检测。综合运用以上这些方法，可以有效地判断菌株的纯度。针对特定的菌株或实验需求，可以进一步定制和细化检测流程。