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生物制剂中“明星”表面活性剂——吐温80

嘉峪检测网        2024-09-30 09:41

介绍:

聚山梨酯(吐温,PS)是一类两亲性非离子表面活性剂家族,其中,聚山梨酸酯80(吐温80)是生物药物制剂中使用最广泛的“明星”表面活性剂,可防止蛋白质在储存、运输条件变性、聚集、表面吸附以及絮凝作用。吐温80是一种混合物,主要成分是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。

作为常用的药物辅料,市售注射用吐温80主要有MC(多药典级)和CP(中国药典级)两种级别,其主要差异在油酸含量上,见表1。其中,CP级别常用供应商日油和南京威尔,MC级别有JT、Sigma和禾大等。

 

吐温80可以通过氧化和水解途径降解,见图1,其中水解反应是化学诱导的或酶催化的,氧化反应一般由化学诱导。吐温80作为生物制剂的一种保护剂辅料使用,但也可能影响蛋白质制剂的质量,从而对功效、安全性和稳定性起到不利作用。目前,药品监管部门对吐温80的控制要求越来越严格。

图1 吐温80的主要降解途径

有很多学者对吐温80进行了大量研究,下面从吐温80的优缺点、含量测定方法、以及面临挑战几个方面进行介绍。

 

吐温80的优点:

PS80是生物制剂中最常用的表面活性剂,在大多数商业治疗性蛋白质制剂中用作蛋白质稳定剂。这是由于以下因素:

1)生物相容性高;

2)低毒性;

3)有效的蛋白质稳定作用。即使在低浓度下(生物制剂中常用浓度为0.1-1.0mg/ml),它们也提供了足够的蛋白质稳定性。这是由于PS80的亲水亲脂平衡(HLB)值高和临界胶束浓度(CMC)低,PS80的CMC仅为1.4*10-2g/L。

蛋白质具有天然的不稳定性,易受到外部条件的影响,如温度、震荡、剪切力、缓冲体系及离子强度等,甚至自身的蛋白浓度或纯度的改变。其中,所有蛋白质变性降解的问题中,聚集的问题尤为严重。下游的制剂开发中常常使用吐温80作为蛋白的保护剂。聚山梨酯稳定蛋白质的机理,通常认为界面竞争和表面活性剂-蛋白质复合这两种主要机理。

吐温80主要通过界面竞争作用来稳定蛋白质,吐温80的表面活性比蛋白质(即单克隆抗体(mAbs))高很多,因此,吐温80可以竞争性地占据界面位置,抑制蛋白质吸附到气液交界面,进而减少与空气接触造成的氧化或聚集,也有效防止蛋白质在制造过程、样品处理和存储中在界面处展开。

吐温80还可以通过与蛋白质直接相互作用,增加蛋白质的胶体稳定性。抗体可能会通过其分子间输水作用形成聚集体。吐温80可通过与蛋白质表面上的疏水相互作用,从而防止蛋白质聚集甚至颗粒的产生。

 

吐温80的缺点:

前面提到吐温80其实是一种混合物,市售的预期结构聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)仅占吐温80总量的20%。如图2所示,异质性主要来来源与工艺相关的副产物杂质,其中不仅含有单酯(预期结构),还含有二酯、多酯,甚至未成酯的脂肪酸链。此外,前面还提到(见图1),吐温80可以发生水解反应及氧化反应导致降解,产生脂肪酸链及氧化物,以上导致对吐温80的表征成为了难点。

图2 吐温80主要的化学结构

 

吐温80的表征:

吐温80的结构缺乏强发色团,无法直接检测到容易获得的紫外可见光及荧光。目前,很多研究学者已经开发了多种表征方法来控制吐温80的不同性质,表2总结了几种常见含量检测方法的原理及优缺点。然而,由于不同亚种(如未酯化、单酯、多酯)及降解产物(如水解、氧化)对总吐温80含量结果的贡献值存在显著差异,因此用不同原理方法测定的吐温80含量显示出明显的差异。

 

此外,还采用MS或CAD(其中主要应用色谱与MS联合应用)来分析主要吐温80亚种的组成及降解物,例如小的有机分子,游离脂肪酸等,研究解聚山梨酯降解途径。药典方法、HPLC-ELSD/CAD方法对水解产物较为敏感,HPLC-FMA也可测出样品水解,然而测定吐温80氧化方面上,FMA方法更胜一筹,综合来看,HPLC-FMA方法更适用于PS80含量的检测。截止目前为止,吐温80的表征方法层出不穷,但具有各自方法的优点及弊端,其仍然是一项分析挑战,必要时可采取多种检测方式共同评价。

 

面临的挑战:

吐温80的水解也就是酯的水解,反应生成的游离脂肪酸链可形成聚集甚至可见颗粒,并且可能与蛋白结合形成脂肪酸-蛋白复合物。在典型的蛋白质制剂pH(4-7)下,吐温80的水解受到限制。有文献表明,酶诱导的吐温80水解是影响产品质量的可见和亚可见颗粒形成的主要原因,实际生产中上游工艺带来的Hcp脂肪酶是催化PS80水解的一个重要因素,其具有与目标蛋白相似的理化性质,因此很难完全去除。即使优化纯化工艺去除Hcp,但远低于检测限的极少量Hcp(ppm级别)也可催化PS80的水解。

吐温80可能被光照、温度,过氧化物、氧气或痕量金属离子等影响因素氧化,氧化位置常见脂肪酸链双键、母核的醚键和部分酯键,降解产物有自由基、过氧化物、游离脂肪酸、短链烷烃、醛、酮、酸等。而生成的过氧化物可能继而引起蛋白质氧化。

泊洛沙姆188(P188)是另一种在蛋白质制剂中用作蛋白质稳定剂的赋形剂,尽管不如吐温80使用广泛。P188因不具备酯键,不会有发生水解的风险,主要通过氧化形式在溶液中降解,形成氧化的聚氧乙烯(POE)和聚环氧丙烷(PPO)。但P188在上市品种中应用局限,可能存在长期放置过程中潜在风险。

因此,推荐使用一些手段减少吐温对蛋白质的负面影响,如2-8℃低温储存、充氮、避光保护;通过上游工艺优化降低Hcp;加入抗氧化剂、金属络合剂等。其中抗氧化剂如甲硫氨酸、赖氨酸、色氨酸等,金属络合剂如EDTA、DTPA等。

 

参考文献:

[1] Characterization of Polysorbate 80 by Liquid Chromatography Mass Spectrometry to Understand Its Susceptibility to Degradation and Its Oxidative Degradation Pathway Journal of Pharmaceutical Sciences 111 (2022) 323−334;

[2] Characterization of Polysorbate Ester Fractions and Implications in Protein Drug Product Stability Mol. Pharmaceutics 2020, 17, 2345−2353;

[3] Degradation of polysorbates 20 and 80 catalysed by histidine chloride buffer European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 154 (2020) 236–245.

 

 

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