内毒素是导致污染药品、制剂成分和医疗器械引起的发热反应的主要原因。重组生物制药产品是使用生物体制造的，包括革兰氏阴性细菌。革兰氏阴性细菌死亡时，其外细胞膜中的内毒素（也称为脂多糖）会释放到裂解液中，它们可以与生物分子相互作用并形成键，包括目标治疗化合物。生物制品的内毒素污染也可能通过水、原料（如辅料）、培养基、添加剂、血清、设备、容器封闭系统以及生产中使用的表达系统发生。因此，生产过程迫切需要通过监测关键步骤的原料和中间体，以及最终药品产品释放测试，来减少和去除内毒素的方法。这篇综述论文重点讨论了三个主要主题：内毒素检测技术、生产治疗分子的上游工艺，以及在产品纯化过程中消除内毒素的下游工艺。最后，我们从高纯度和低成本的角度评估了内毒素去除工艺的有效性。

内毒素的"身份证"

内毒素存在于革兰氏阴性细菌的外细胞壁中，膜的完整性和稳定性得到增强，且在细胞破裂时释放其成分到外部环境。因此，使用革兰氏阴性菌生产生物制品时，可能会带来内毒素的污染。此外，生物制品的内毒素污染还可能通过水源、原料、设备、容器封闭系统以及生产过程中使用的表达系统等途径发生。

结构：内毒素由三个部分构成，长链多糖 (O-抗原)，核心多糖和脂质A (图 1a从上到下)。长链多糖是一种由重复寡糖亚基组成的菌株特异性表面抗原，核心多糖具有外部己糖区和内部庚糖区，脂质A是一种非极性脂质结构。

物理性质：核心多糖和O-抗原都是亲水的，而脂质A是疏水的。内毒素非常稳定，不易被加热条件和pH破坏。内毒素还可能与目标蛋白形成稳定的相互作用，这会使分离变得复杂。

毒性和剂量：内毒素的毒性与脂质A相关，脂质A会触发促炎细胞因子的产生和凝血级联反应的激活，从而导致败血症和败血性休克。每小时每公斤体重仅1 ng的内毒素就可引起热原反应。内毒素测量的标准单位是内毒素单位 (EU)，相当于0.1 ng大肠杆菌内毒素的活性。对于静脉注射，每小时最多可以给患者每公斤体重注射5 EU的内毒素，可接受的浓度取决于所需剂量。

图 1. (a) 来自大肠杆菌内毒素的化学结构示意图，内毒素是由长链多糖 (O-抗原)，核心多糖和非极性脂质A尾部构成的脂多糖结构 (b) 内毒素以胶束，立方体，层状或囊泡形式聚集，在药物溶液中呈现净负电荷。带负电荷的“胶束”内毒素可以吸附在多聚阳离子配体上，或者可以通过疏水脂质尾部与疏水表面的相互作用去除单个内毒素单体

内毒素的检测方法

内毒素的检测技术多种多样，但在此，我们将重点介绍一种目前被广泛采用的检测手段——鲎变形细胞裂解物检测法，也就是我们常说的鲎试剂（LAL）。

与早期需要活体兔子进行的兔热原检测（RPT）相比，LAL方法避免了使用动物实验，转而利用鲎的血液提取物来进行检测。这种提取物主要通过以下三种形式被应用：

凝胶法：此法将鲎血液提取物与待测样品等量混合，若形成凝胶并稳固于试管底部，即判定为阳性。阳性反应需一定量的内毒素触发，检测限在0.03-0.06EU/mL之间（见图2a）。

显色法：此法将凝胶法中的天然底物替换为可显色底物，该底物在内毒素激活的凝固酶作用下裂解，释放显色分子至溶液中，通过分光光度法测量，吸光度变化与内毒素浓度成正比。

浊度法：与显色法相似，浊度法通过测量溶液的浊度来评估鲎试剂与内毒素反应后的凝固效果，浊度变化率与内毒素浓度成正比。

以上三种LAL方法都依赖于鲎血液中的同一种蛋白质，即图2c所示的C因子。内毒素激活鲎试剂中的C因子后会发生凝血级联反应，随之激活因子B，然后进一步形成凝固酶。

显色法和浊度法都可以通过终点法或动力学法的形式测量。终点法：在样品反应终止时进行一次性测量，根据最终的吸光度或浊度与内毒素浓度的关联来确定结果。动力学法：与终点法相比，动力学法通过在整个反应过程中连续监测吸光度或浊度的变化，来动态评估内毒素浓度的动态关系。

图 2. (a) 内毒素诱导的鲎循环血淋巴防御机制。鲎变形细胞裂解物 (LAL) 检测是根据鲎血液中产生的免疫原性反应设计的。暴露于内毒素后，电子致密的大颗粒 (L 颗粒) 和电子密度较低的小颗粒 (S 颗粒) 变形细胞会被酶原C因子激活; (b) 鲎血凝血级联反应。内毒素激活质膜结合C因子，C因子是一种单链糖蛋白 (分子量123 kDa)，由重链 (分子量80 kDa) 和轻链 (分子量43 kDa) 组成，在免疫系统中起着关键激活剂的作用。因子与内毒素结合后，自催化活性触发 Phe-Ile 键的裂解，从而产生活化的C因子，该因子与B因子相互作用，将其转化为凝固酶。凝固酶在肽C的两个末端 (Arg-Lys和Arg-Gly) 处裂解凝固蛋白原，形成不溶性凝固蛋白凝胶；(c) 鲎血中活性凝固酶的蛋白水解活性特征可用于合成显色剂，即 Gly-Arg-p-硝基苯胺底物 (而不是凝固素原) 通过分离对硝基苯胺 (pNA) 来检测内毒素。添加显色底物后，活性蛋白酶凝固酶 Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA 会催化 pNA 的释放，产生黄色，可通过测量405 nm处的吸光度 (或 340 nm 处的吸光度) 与标准曲线关联获得内毒素浓度

上述所有LAL方法都被目前生物制药机构广泛接受，并推出了诸多具有不同检测精度的试剂盒 (表 1)。需要注意的是，LAL检测方法仍然存在一些缺陷：

假阴性：内毒素会被样品中一些特殊缓冲液成分 (如柠檬酸和磷酸)，细胞培养基组分，表面活性剂 (如PS20和PS80) 或产品聚集掩盖。干扰试剂会在内毒素分子周围形成一层掩蔽层，使其无法与LAL试剂发生反应，这种现象通常伴随着检测中的低内毒素回收率。理论上，待测样品中能与内毒素活性位点结合的游离金属离子，肽，聚合物和蛋白质都可能中和其生物活性，造成LAL检测所依赖的级联反应被破坏。

假阳性：(1→3)-β-D-葡聚糖 (一种主要的细胞膜致热原成分) 会触发蛋白酶G因子通路，并形成与LAL反应中相同的凝固蛋白终产物，因此待测样品中含有该葡聚糖会造成假阳性。

表 1. 目前三种LAL检测方法 (显色法、凝胶法和浊度法) 的商品化试剂盒，以及基于rFC检测法的商品化试剂盒

文中提到的其他内毒素检测方法在此只对基本原理做简单介绍，感兴趣建议下载文末原文阅读：

兔热原检测 (RPT)：这是一种传统的内毒素检测方法，通过注射生物样品至活兔体内，观察180分钟内体温是否升高0.5℃来判断。该方法因依赖活体、样品消耗大且精度和灵敏度有限，使用已逐渐减少。

牛全血检测 (bWBA)：通过将牛全血与待测样品混合，利用白细胞对内毒素的反应产生PGE2，其量与内毒素浓度成正比。但此方法存在缺陷，如内毒素的非特异性结合可能掩盖单体，且牛全血不易收集。

重组C因子检测：基于LAL原理，通过DNA克隆得到的重组C因子，不含G因子，避免了LAL中的非特异性糖结合导致的假阳性，检测成本与LAL相当。

单核细胞活化试验 (MAT)：内毒素激活单核细胞产生细胞因子，通过一系列反应，最终通过分光光度计测量吸光度来定量内毒素，与LAL显色法类似。

新兴方法之电化学技术：多数基于电化学阻抗谱 (EIS)，通过电极与待测溶液接触，测量内毒素与电极-蛋白质复合物接触后电阻的变化来检测。

新兴方法之荧光和发光技术：利用生物发光法，将LAL测试中的终点物质pNA作为荧光素酶的底物，通过生物发光反应快速检测内毒素。

新兴方法之表面等离子体共振和基于质量的技术：等离子体生物传感器使用光纤探头技术，通过测量折射率变化监测内毒素结合。电磁压电声传感器 (EMPAS) 则基于PMB功能化的石英表面，利用PMB对内毒素的高亲和力进行检测。

内毒素的下游去除方法

在生物制品的整个制造过程中，下游工艺的内毒素去除是控制内毒素水平的关键环节。内毒素自身或与目标蛋白形成的稳定相互作用，对下游去除工艺构成重大挑战。本文主要探讨了超滤、萃取、离子交换层析、亲和层析和膜吸附等去除技术。

图 3. 生物制药生产，分离和纯化步骤的简要流程图，主要分为上游发酵 (细胞培养) 和下游纯化两个部分

1. 超滤

单个内毒素分子的分子量通常在10-30 kDa之间，它们的核心多糖和寡糖链能聚集形成高达1000 kDa分子量、直径约0.1 µm的胶束和囊泡（见图2b）。

超滤膜技术，具备固定孔径，能有效从小分子目的蛋白溶液中分离出大分子胶束和囊泡。内毒素从单体到胶束的形态转换，对超滤去除效率有显著影响。

蛋白浓度：例如，使用100 kDa截留量的超滤膜时，大于100 kDa的蛋白和内毒素胶束会被截留，而小于100 kDa的内毒素单体则能通过膜。研究表明，稀释蛋白溶液可提高内毒素的去除率，因为在较低浓度下，一些大分子的内毒素聚体可能解离成能透过膜的单体。

去垢剂浓度：例如，PS20能够促使大分子内毒素聚体解离为单体，同时削弱内毒素与目的蛋白的结合，便于超滤膜的去除。随着PS20浓度的增加，内毒素的去除效率也随之提高。

应用范围：超滤技术适用于从小分子量目的蛋白、水或盐溶液中去除内毒素。在这一过程中，超滤回流端会截留大分子内毒素，而小分子目的蛋白则透过膜。需要注意的是，膜孔径的选择对收率有显著影响，如使用10kDa膜的收率可达95%，而3kDa膜的收率可能降低约55%。

2. 萃取

溶剂萃取根据内毒素在两种不混溶液体中的相对溶解度差异将内毒素与目标治疗药物分离。内毒素通常在有机相中形成分布，而亲水性目标分子则留在水相中。该方法对于高度污染样品可以提供高内毒素去除效率，但是目标产品的收率损失可能会比较大。

案例一：1-辛醇作为有机相在去除T4、HAP1和F8噬菌体的内毒素方面表现出64%至99.9%的高效率，但需注意其收率较低，仅为30-60%。此外，1-辛醇在水相中的残留可能在LAL检测中引起背景噪音。

案例二：利用去垢剂Triton X-114结合温度变化可有效去除绿色荧光蛋白中的内毒素。Triton X-114在0°C时与水完全混溶，而在23°C以上则发生相分离。在低温时，Triton X-114、内毒素和荧光蛋白共存于水相；温度升高后，内毒素随Triton X-114转入有机相，目标蛋白则保留在水相中。

3. 阴离子交换层析

阴离子交换层析的配基带正电，内毒素的等电点约为2，在绝大多数层析条件下 (pH>2) 内毒素都带负电，而碱性目的蛋白则为正电荷。阴离子交换介质在此条件下能够有效地结合内毒素，允许目的蛋白通过，实现两者的有效分离。然而，对于带有负电荷的酸性蛋白和质粒DNA（pDNA），在确保产品收率的同时，阴离子交换层析在去除内毒素上的效果可能会受限。

缺陷或限制：如果内毒素和目的蛋白有强相互作用，其可能会随目的蛋白一起流出层析柱，这时可以通过调高样品pH来减弱内毒素和目的蛋白之间的相互作用。如有案例在pH 7.9, 8.4, 8.9和9.2时检测到的流穿液中内毒素浓度分别为1400, 1800, 600和500 EU/mL，并且对目的蛋白的收率没有显著影响。

去除效果：一般阴离子层析可使浓缩的溶液 (>1,000 EU/mL) 中内毒素减少5个数量级，或使稀释的溶液 (<100 EU/mL) 中内毒素减少3-4个数量级。

4. 亲和层析

亲和层析技术利用与内毒素具有高度特异性结合能力的配体，有效地从目标蛋白质中分离出内毒素。这些配体通常针对内毒素中最保守的脂质A结构进行设计，其作用力包括疏水作用和静电作用。

最常用的亲和配体包括脱氧胆酸、二甲胺配体、组氨酸、多粘菌素B (PMB) 和聚阳离子配体等。

PMB：PMB是最常用的配体之一，一种对内毒素具有高亲和力的环状脂肽。PMB可以诱导内毒素聚集体的解离，并通过疏水相互作用与内毒素的脂质 A部分结合。PMB层析柱的缺陷是可能会出现高于平均水平的产品损失，这是因为PMB上的氨基酸基团带正电荷，可能会吸引带负电荷的目标分子。此外，PMB既有神经毒性又有肾毒性，如果配体从填料中脱落可能会引起安全问题。

含氮碱基腺嘌呤、胞嘧啶、组氨酸和组胺都对内毒素具有亲和力。其中，组胺和组氨酸与PMB一样有效，已成功将内毒素与白蛋白、胰岛素、溶菌酶、肌红蛋白和其他物质分离。许多重组蛋白都携带组氨酸标签，内毒素和组氨酸的相互作用可能导致样品污染，替代方法是使用其他如GST标签等。

商品化填料 (表2)：成本效益高的配体及其结合能力是纯化过程中去除内毒素的关键因素。聚-ε-赖氨酸和PMB是常用的两种配体。表2汇总了这些配体相关商品化产品的内毒素结合能力、蛋白质回收率、可再生性和成本。

缺陷和新产品：上述树脂的使用涉及重组蛋白回收率低，肾毒性和神经毒性导致的静脉应用困难，填充床形式的多孔树脂存在的高压降和传质效率低等缺陷。已经有研究开发出约800 nm的聚ε-己内酯 (PCL) 纳米粒子去除PBS缓冲液，蛋白质溶液和水中的内毒素。具有生物相容性好，刚性，无孔 (吸附发生在表面)，高内毒素去除率 (99%) 和高回收率 (>95%) 等优势。

图 4. 去除内毒素的不同配基化学结构

表 2. 层析法去除内毒素的配体比较

5. 膜吸附

与传统的柱层析技术相比，膜层析技术在提高生产流程速度和减少扩散限制方面具有显著优势。膜层析的膜材料可以选用多种不同的材料，包括纤维素、醋酸纤维素、尼龙、聚乙烯醋酸乙烯酯、聚乙烯醇和聚偏氟乙烯等。

案例分析一：已有研究报道使用固定化组氨酸标签的尼龙膜来清除内毒素，但随着初始内毒素浓度的增加，其清除效率会逐渐降低。例如，在初始内毒素浓度为387 EU/mL的最低水平时，清除效率也仅为65%。

案例分析二：一些研究人员已经开发出一种新型的膜吸附剂，它不仅具有高效的内毒素清除能力，还具有良好的结合性能。这种以聚偏氟乙烯（PVDF）为基材的吸附剂，通过添加两亲性碳质颗粒，成功地从牛血清白蛋白溶液中清除了内毒素，清除效率超过99.8%，同时蛋白质的回收率也超过了90%。

表 3. 膜吸附用于内毒素去除的比较

结论

对于能够以较低成本生产高质量产品技术的需求正在增加。对于使用革兰氏阴性细菌生产的生物制药来说，这一点尤其正确，因为内毒素污染是一个问题。基于动物的内毒素检测技术将变得过时，取而代之的是电子生物传感器和基于荧光的技术。需要实时在线监测工艺流程中内毒素浓度，以便对产品污染采取反馈措施，并保持生产生物制品和药物的安全标准。开发同时检测和去除内毒素的方法，既要有效又要成本效率高，由于所需的高纯度和内毒素与目标分子之间的潜在相互作用，这是一个持续的挑战。亲和层析是最有前途且应用广泛的内毒素去除方法，因为内毒素和所选配体之间具有高度选择性的相互作用。仍需进行额外研究，以进一步开发高效的内毒素去除方法和具有高亲和力、低成本和低毒性的靶向配体。这些创新将使产品质量和产量提高，同时降低制造成本。