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中美药典细菌内毒素检查法应用指导原则的比较和解读

嘉峪检测网        2024-12-31 19:22

摘要

 

目的

 

为国内细菌内毒素检测、研究和药物警戒工作提供参考。

 

方法

 

参考《美国药典》1085 细菌内毒素检查法应用指导原则和《中国药典》 9251 细菌内毒素检查法应用指导原则,对中国与美国内毒素标准物质管理、质量管理的异同及指导原则中容易误读的要点等相关内容进行介绍和解读。

 

结果

 

中国与美国细菌内毒素检查法应用指导原则均在2020 年被首次收载,在背景、检测、工作标准品标定、质量管理、限度计算、替代方法等方面给予了详细指导和论述。

 

结论

 

中国与美国内毒素检查法应用指导原则作为细菌内毒素检测领域的权威指导原则,为内毒素实验室检测人员及《中国药典》修订提供帮助与启示,并将在实践中不断调整和完善。

 

关键词

 

细菌内毒素;中国药典;美国药典;解读

 

《中华人民共和国药典》(2020 年版)(简称“《中国药典》”)收载了 9251 细菌内毒素检查法应用指导原则。同年,《美国药典》(47 版)(简称“《美国药典》”)也收载了1085 细菌内毒素检查法应用指导原则。表明细菌内毒素检查法在世界范围内经过多年发展,为了应对新的情况,均需要进行新的官方解读和指导。中国与美国药典中的内毒素检查法指导原则具有多项不同,本研究参考《美国药典》1085 细菌内毒素检查法应用指导原则和《中国药典》9251 细菌内毒素检查法应用指导原则,对中国与美国内毒素标准物质管理、质量管理的异同,指导原则中易误读的要点解读等相关内容进行介绍和探讨,解读异同产生的背景和原因,为内毒素检测从业者提供参考。

 

1、中国与美国药典内毒素检查法指导原则主要内容差异

 

《美国药典》1085 分为背景、预备性试验、方法适用性、日常检测、替代方法、词汇表、参考文献7 个项目来进行介绍 ,与《中国药典》9251 中的内容部分重叠(表 1)。

 

 

2、中国与美国药典指导原则的解读

 

中国与美国内毒素检查法指导原则体例不同,因《美国药典》相较《中国药典》对应条目更多,因此本文按照《美国药典》的体例逐一展开,先介绍《美国药典》的内容,涉及到《中国药典》内容时,在本条目中对比中国与美国药典进行介绍。

 

2.1 背景知识

 

含有热原的药物或医疗器械进入哺乳动物的血液或脑脊液后,会引起发烧等热原反应。进入体内的方式包括注射、输液,植入等形式。尽管某些生物制剂、疫苗以及细胞和基因疗法自身的药理活性可能会引起患者发热,但注射剂和医疗器械生产中最主要和最易致热的污染物是细菌内毒素,其为革兰阴性细菌(gram-negative bacteria, GNB)细胞壁的组成部分。

 

术语“细菌内毒素”或“内毒素”是指GNB外细胞膜的复杂成分。具有生物活性的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),包括各种蛋白质、磷脂和脂蛋白。LPS分子的疏水脂质A部分嵌入膜中,亲水多糖部分暴露于细胞周围的外部环境。内毒素可能会在GNB 死亡后在细胞壁片段中保持活性,因此供试品可能是无菌的,但仍可能检测出内毒素。注射剂(包括生物产品)或医疗设备中存在细菌内毒素时,表明GNB的生长发生在产品制造过程中的某个时间点。药品生产过程中,污染内毒素的方式有多种,可能源自药物成分(包括水,原料,赋形剂,包装材料,清洁或存储的制造设备),也可能由于控制措施失效 。

 

当前的中国和美国的内毒素标准物质分为参考标准品(endotoxin reference standard, RSE,中国称为国家标准品)和商业制备的对照标准内毒素(Control standard Endotoxin, CSE,中国称为“工作标准品”),通常是通过Westphal热酚法从 GNB 细胞膜中提取出来,并进行纯化以去除其他的细胞膜成分 。此外,这些纯化的制剂通常还与稳定剂 一起配制。但污染药品的是自然内毒素,不会是使用 Westphal 或其他提取方法制备的纯品 LPS。因为自然内毒素本质上不以这种纯品形式存在。由于内毒素来源和制备方式的差异,内毒素标准品可能与天然来源的内毒素有不同的反应。即在一些情况下,标准品中的内毒素和自然内毒素的活性不完全相同 。这些标准品在某些样品(药物,生物制品或医疗器械)回收率实验中可能无法代表天然内毒素。

 

尽管细菌内毒素检查法是通则方法,但仍然需要验证相关内容:计算或指定被测物质的内毒素指标或限值,以及计算最大有效稀释倍数(maximum valid dilution, MVD);然后试验证明可以在不超过MVD的稀释下供试品阳性对照(positive product control, PPC)成立。一旦证明了检测的适用性,实验室可以根据适用性研究中所述的计算和样品制备条件进行常规测试。对条件的更改(如鲎试剂和/或内毒素的来源、配方或生成工艺的更改等)必须进行更改控制,并可能需要重复进行适用性研究 。

 

2.2 预备性试验

 

《美国药典》在预备性试验中主要包括2 部分内容:第一部分,有关工作标准品的标定,分为使用RSE 对CSE的校准、使用凝胶法确定 CSE效价、使用定量的动态法和终点法确定 CSE效价、液体CSE的活性测定4个部分内容;第二部分,关于细菌内毒素检测的质量管理,分为试验人员资质、设备和仪器的校准与检定、实验室环境条件 3 项内容。

 

《中国药典》中目前没有收载有关标准品标定内容。原因在于,我国与美国对内毒素工作标准品的管理和使用有较大差别。RSE由美国食品药品监督管理局(US Food and Drug Administration, FDA)生产并组织协作标定给赋值,CSE 由鲎试剂生产厂家生产并根据 RSE 来标定 CSE。我国国家标准品和工作标准品由国务院药品监督管理部门依法设立的药品检验机构生产并组织协作标定赋值。一般药品质量控制者在使用鲎试剂时,如果使用的是我国的鲎试剂,则应选择使用中国的标准物质。如果使用的是进口鲎试剂,则应按其要求使用对应的内毒素标准物质,不应交叉使用。

 

关于内毒素检测方面的质量管理内容,在我国符合实验室认可的相关规定即可。本实验室的研究人员对内毒素检测的质量管理内容已进行过较为详细的介绍,可供相关检测人员参考。

 

2.3 方法适用性

 

《美国药典》在本部分共有 3 部分内容,包括细菌内毒素限值的确定、MVD 和干扰的排除。在限度的确定方面,《美国药典》基本囊括了所有内容,包括注射用药品、眼部用产品、复合无菌制剂、活性底物和赋形剂、药械组合产品以及医疗器械等。《中国药典》只对注射用药品的限值确定做了相关要求,但对于多种规格的注射剂以及原料药制定内毒素限值的制定方面给予了明确指导。《美国药典》在MVD 的介绍方面提出,当产品在 MVD 显示阳性时,表明其不符合内毒素限量要求,在这种情况下,可以使用超过 MVD 的稀释倍数来进行检验。并建议实验室可通过稀释至阴性(凝胶法)或到达标准曲线上的有效读数(定量法)的方式来确定产品中细菌内毒素的总含量。在有关干扰因素方面,《美国药典》比较详细地介绍了一些常见的干扰因素产生的原因和排除的方法。

 

《中国药典》在“供试品的前处理方法”中重点介绍了目前细菌内毒素检测的一些难题,如微球脂质体等采用包合技术制备的特殊样品,及难溶性的注射用原料药和辅料,应采取特殊的前处理将微球和脂质体以及难溶性样品被包裹的内毒素释放出来,再进行检测,并且针对不同类型的样品给予了不同的建议 。这部分内容是国内针对各类情况进行总结概括提出的指导,具有很好的可操作性。《美国药典》对此没有叙述。

 

2.4 日常检测

 

2.4.1 采样

 

《美国药典》对于样品的采集要求给予了充分的介绍。包括对取样所有材料(勺子、移液管、瓶)的质地要求,采用必须采取的预防措施,生产中循环水系统中如何取样,粉状和颗粒状固体尤其是对于高黏度材料如何取样和应注意的问题等 。《中国药典》对采样部分没有特别介绍。

 

2.4.2 合并

 

《美国药典》对于样品的检验,允许进行“合并”检验。术语“合并”是指制备一个混合样品制剂,其中包括来自相同批次或不同批次的等分试样。对于在药物产品上进行细菌内毒素检测分析的实验室而言,合并是可接受的选择。但是,合并有许多缺点,最明显的是,其会稀释任何一个单位中的内毒素,从而可能掩盖了内毒素含量。因此应尽量设计科学合理的抽样计划。如果合并检测,则必须调整 MVD。调整后的 MVD 是通过将原始计算出的MVD 除以合并的样品数来计算的。例如若小剂量肠胃外药物的 MVD 为 240,而制造商选择合并 3 小瓶样品进行测试,则调整后的 MVD 为 240/3,即 80。这种 MVD 的缩小有效地降低了产品的内毒素限量因子来补偿合并。虽然合并可能会使鲎试剂的使用量减少而节省成本,但是合并时需要注意:合并可能会掩盖各个样品单位之间内毒素含量的任何不均匀性,而不均一污染的信息可能在排除故障或调查中很有价值。应当始终使用无菌技术进行等分试样样品的合并,并在取出等分试样之前与各个单元剧烈混合。如果出现超标(out-of-specification, OOS)测试结果,应保留带有剩余产品的原始容器以进行调查。建议使用无热原的注射器通过消毒的橡胶塞子取出等分试样,以便在随后进行的调查测试时保持每个容器的完整性。调整后的 MVD 的概念不适用于医疗器械。药品的任何抽样方案都必须代表批次的开始、中间和结束。如果怀疑在制造过程中有可能存在内毒素的污染,则应增加取样。

 

如果在调整后的 MVD下产品的干扰不能排除,则应单独测试样品。计算出 MVD 较低的产品,或无法保证所取等分试样均一的悬浮液,可能不是合并的良好选择。合并不适用于过程中的样本,尤其是代表制造不同阶段的样本。

 

虽然合并检测内毒素的方法在《美国药典》的框架下是一种可被接受的方案,但在我国的质量控制实践中则较少被提及。目前国内的内毒素质量标准中,也没有采用多支样品的情况。因此《中国药典》中没有关于合并检测的相关内容。

 

2.4.3 超标结果和重新测试注意事项

 

应明确无效试验和有效试验的概念。由于系统适应性参数(如阴性对照,PPC,凝胶法中的鲎试剂灵敏度复核试验或光度测定法中的标准曲线的可靠性试验)的情况会影响测试结果的准确性。系统适应性参数未按预期发挥作用的试验被称为无效试验,应该跟踪调查无效试验并努力寻找可能需要采取纠正措施的模式和趋势。系统适用性参数全部成立,并经过全面的调查排查,不存在任何的异常情况,此时的结果则被认为是有效的。真正的 OOS 结果仅在执行了有效的测定并产生超出规格的结果时存在。无效的测试不是OOS结果。《美国药典》还对OOS调查的内容进行了描述。《中国药典》中没有专门关于细菌内毒素检测 OOS 结果的规定。

 

本实验室针对细菌内毒素的OOS进行了较为详尽的研究,归纳了OOS产生的原因和解决方案 。

 

2.4.4 标准曲线控制

 

在终点浊度法和终点显色法中,通过评估浊度(色度)强度和标准浓度之间的直接关系,所建立的标准曲线具有正斜率,曲线的相关系数必须≥ 0.980。在动态浊度法和动态显色法中,通过绘制反应时间的对数值和标准内毒素浓度的对数值的来绘制标准曲线,数据的这种转换会导致标准曲线的斜率为负,并且相关系数必须≤ -0.980。综上,药典对光度测定法中的线性要求是 | r | ≥ 0.980。并要求用 3 个有效数字表示,最后一个“0”很重要;在一个控制良好的实验室中,相关系数通常大于 0.980。所有标准曲线都有一个对应的线性方程 y = mx + b,其中 m 是标准曲线回归线的斜率,b 是 y 轴截距。由于数据进行了对数转化,因此定量分析的标准曲线可能对达限时间(onset time)的微小变化非常敏感。

 

测试结果的准确性取决于标准曲线的准确性。因此,对每个批次的鲎试剂的达限时间进行监控十分必要 。如分析人员可以在标准液的稀释中产生2倍或10倍的稀释误差,但仍然可以生成满足 | r | 要求的线性标准曲线≥ 0.980。仅通过查看相关系数难以注意到稀释误差,应观察标准品的达限时间与稀释准确的标准系列相比。稀释误差也将反映在 y 截距生成的值中。斜率的变化也会影响测试数据的准确性。建议在对分析人员进行定量分析的培训中,强调可变性(CV)对测试结果准确性的影响。

 

《中国药典》关于标准曲线给出的操作细节方面的信息较《美国药典》少,但要求方面与《美国药典》一致。

 

2.5 替代方法

 

在通则细菌内毒素检查法中列出的用于检测细菌内毒素的方法(凝胶限度法、凝胶半定量法、动态显色法、终点显色法、动态浊度法、终点浊度法)是法定方法。但实验室可以选择使用内毒素检查法中未列出的测定方法。如果做出这样的选择,则必须充分验证用于检测细菌内毒素的替代方法,以确保使用的替代方法等同于或优于现有的内毒素检查法,并最终由相应的监管机构批准。可以在《美国药典》1223 替代微生物方法的验证和《美国药典》1225 药典程序的验证中找到有关如何进行替代方法的验证 。

 

《中国药典》关于替代方法的要求与《美国药典》类似,《中国药典》规定如果使用 1143 细菌内毒素检查法以外的方法,应遵循药典凡例的要求进行验证,即可作为现有药典方法的补充方法使用。本实验室针对重组 C 因子和微量凝胶法为替代方法分别进行了方法学和品种适用性研究,并针对替代方法的应用进行了详细解读 。

 

2.6 产品内毒素检查法的建立

 

《中国药典》对产品的内毒素检查法的建立有专门的规定,此部分内容《美国药典》中没有相关规定。《中国药典》规定为了验证样品和不同厂家鲎试剂反应的一致性:应使用 2 个生产厂家的鲎试剂对至少 3 批样品进行干扰试验。并且明确建议了不宜建立细菌内毒素检查项的情况:无法排除供试品对细菌内毒素检查的干扰作用或只能使用最高灵敏度鲎试剂(凝胶法 0.03 EU·mL-1,光度法 0.001 EU·mL-1)。这2方面规定充分考虑了中国的鲎试剂管理、生产和使用的特点,具有较强的实际意义。

 

3、内毒素检查法指导原则的意义

 

药典中的检测方法众多,专门为检测方法的应用建立的指导原则并不多见。细菌内毒素检查法是药品安全性的重要检查项目,中国与美国等国家药典中专门收载细菌内毒素检查法的指导原则体现出该方法在药品质量控制中的重要地位。同时也说明该方法在应用过程中需要特殊注意的方面较多。无论是国内外内毒素检测应用方面的研究仍然是研究热点。

 

4、结论

 

4.1《中国药典》在方法的选择、供试品的前处理方法、产品细菌内毒素检查法建立给予了较多指导

 

随着内毒素检查法在中国的发展,出现了以下 5个主要问题,包括:更多种类的样品需要制定内毒素限度;伴随光度法鲎试剂的国产化,国内用户在试验方法上可供原则也更加宽泛;新型制剂、难溶性样品内毒素检测新问题的出现;国内多厂家鲎试剂差异仍然存在;替代方法的出现。《中国药典》内毒素检查法针对国内的发展阶段,有针对性地对上述 5 个方面给予明确指导和要求。

 

4.2《美国药典》在生产过程中、实验细节、质量管理给予了较多指导

 

细菌内毒素检查法作为一种生物检定而非理化检测方法,《美国药典》为了使得更多从业者正确理解内毒素检查法特性,在指导原则中介绍了大量的内毒素检测相关知识和信息,从细菌内毒素的基本性质到实验中的细节信息,再到生产和检验过程中的质量管理。对于新的从业人员了解,掌握细菌内毒素十分有益。

 

4.3 中国与美国内毒素检查法指导原则各有特色

 

《美国药典》给予的检测相关信息较多;《中国药典》给予的明确要求较多。在实际应用中,对于中国的药品从业者,了解相关知识和信息后,有利于对内毒素检查法加深理解,并可同时遵照《中国药典》的要求执行。

 

综上所述,中国与美国细菌内毒素检查法应用指导原则均为收载于药典中的指导原则,根据中国与美国实际情况而具有不同的侧重点,《中国药典》中的指导原则倾向于在检验应用方面;而《美国药典》的指导原则倾向于生产过程方面。中国与美国药典收录内毒素检查法应用指导原则,为内毒素检测工作者提供了权威的技术指导原则,更加有力地保障药品的质量安全。

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来源:领康时代CDMO