实时荧光定量PCR（简称RT-qPCR），通常将提取细胞或者组织的总RNA逆转录成cDNA。之后以cDNA为模板，以dNTP 为底物，对扩增出的DNA进行定量分析。

在这里以下是对miR-A的qPCR数据（来自Bio-Rad仪器）进行统计分析的详细步骤：

（1）以miR-A为目的基因，内参为U6：检测相对于对照组，实验组miR-A的相对mRNA表达水平，以下为Bio-Rad仪器导出的数据：

图1原始数据

（2）拿到原始数据我们一般只需看图1中标红的①②③列数据，并将数据复制粘贴值新的工作表中，对数据进一步处理。对目的基因进行相对定量分析，则使用ΔΔCt法，Bio-Rad仪器中的Cq即为基因的“CT值”，计算公式如下：

实验组目标基因相对于对照组的相对表达量=2-ΔΔCt

1）A:计算Ct值：分别测定目的基因和内参基因在实验组和对照组中的Ct值，即原始数据中的Cq值。

B:计算ΔCt值：对于每个样本，计算目的基因与内参基因的Ct值之差（ΔCt = Ct目的基因-Ct内参基因）。

C:计算ΔΔCt值：实验组ΔCt值与对照组ΔCt值之差（ΔΔCt = ΔCt实验组 - ΔCt对照组）。

（3）计算原始数据，我们在新的Excel工作表中制作以下表头：

图2 表头以及数据统计

（4）具体计算步骤：

1）用【average】函数分别求出对照组和实验组中U6内参Cq值的平均值 ；

图3 内参Cq值的平均值

注意：目的基因的Cq值减去内参基因的Cq值的平均值，是用于归一化目的基因和内参基因的反应量，从而消除实验操作和RNA提取效率等因素的影响，得到更准确的相对定量结果。

2）随后，再用①对照组和实验组目的基因的各个Cq分别减去②内参Cq值的均值即为③ΔCq；之后求出④对照组（目的基因Cq-内参Cq均值）的均值；

图4 实验组ΔCq

图5 对照组ΔCq

图6 对照组（目的基因Cq-内参Cq均值）的均值

3）③目的基因的各组ΔCq值再减去④对照组（目的基因Cq-内参Cq均值）的均值即为⑤ΔΔCq，最后用【Power】函数计算2-ΔΔCq值，：

图7 ΔΔCq计算

4)最后用⑥【Power】函数计算2-ΔΔCq值，excel选择下拉得到所有值，具体计算如下：如图3：

图8 【Power】函数计算2-ΔΔCq值

5)整体计算数据如下，我们最后求出三次技术重复的平均值⑦，即为我们一次生物学重复的值:

图 9 整体数据计算

（5）因此，步骤（4）中计算得出了一组数据即为一次生物学重复，将对照组的目的基因表达标准化。相对于对照组，实验组的miR-A的相对表达量降低了；但实际上我们需要三次生物学重复才能得到这样的结论。

注意 ：技术重复是指相同的样品同时做3-4个平行，用于消除人为的系统误差，筛选测出比较准确的值；而生物学重复是指我们需要消除样品的差异，避免结论的偶然性，即不能用一次生物学重复便得出结论。例如一些临床样本可能就需要一般患者和健康者的样本数要n>15。图3中Test/Normal的3个数据分别为一次技术重复，一组为一次生物学重复。

（6）统计分析：使用适当的统计检验方法（如T检验、ANOVA等）来评估不同组之间基因表达差异的显著性。图中我们以三个技术重复为例用graphpad prism作为分析miR-A的相对表达量。结果用Graphpad软件作图如下：

图 10 miR-A的相对mRNA表达水平

注意事项：

（1）对于原始数据，我们要去除潜在的干扰物质、识别和处理异常值（如由于实验误差或仪器故障导致的极端值）。

（2）确保每个样本至少有三次生物学重复，以提高数据的可靠性。

（3）得到数据后，我们可以在Bio-RadPCR仪上查看数据的有效性，例如查看数据溶解曲线是否为双峰，引物特异性是否有问题；查看扩增曲线、扩增效率是否正常等。

（4）另外还需要注意的是一组数据之间正常的数据重复需要可靠，因此一个基因的实验组或者对照组我们通常会设置3-4个复孔减少加样误差，通常的技术重复孔之间数据相差±0.5个Cq值均不能使用。