qPCR（或称Real-time PCR、Real-time quantitative PCR、实时荧光定量PCR）技术，是指在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行绝对定量分析或者利用内参基因进行相对定量分析的方法。

做qPCR实验，目前大多数科研工作者出于实验需要和成本的原因会优先考虑染料法。

染料法实验设计简单，仅需2个引物，无需设计探针，初始成本低，灵敏度高。SYBR Green I是qPCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA（dsDNA）非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green I不发光，但一旦与dsDNA结合，其荧光大大增强。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出现的dsDNA量成比例，且会随扩增产物的增加而增加。

SYBR Green I染料法简单方便，但最大的缺点是缺乏特异性，即染料可以结合任一dsDNA。qPCR反应中非特异性产物的出现会增加荧光值，影响定量结果的准确性。因此，需要进行熔解曲线分析检验扩增反应的特异性。

什么是熔解曲线？

染料法qPCR反应结束后，对qPCR反应体系进行升温，dsDNA在加温过程中逐渐解链，结合的SYBR Green I逐渐析出，荧光强度也随之下降。当加热温度达到dsDNA的退火温度（Tm值）时，在此温度下，dsDNA会解链一半，随后迅速解链，荧光信号会骤降，形成荧光信号曲线上变化的拐点。

对荧光信号曲线进行负一阶求导，就得到熔解曲线图，熔解曲线峰值对应的X轴的温度，就是双链DNA的Tm值。

为什么熔解曲线可以检验扩增反应的特异性？

由于产物的Tm值取决于PCR产物的长度，GC含量和碱基匹配状况等原因。当只有一个熔解曲线峰，说明只有一种单一产物；但如果有两种产物，长度或碱基组成不一样的话，就会产生两个熔解曲线峰，即我们通常说的双峰。一旦产生双峰，说明扩增反应中存在非特异扩增存在。

理想的熔解曲线

我们来看看，理想的熔解曲线峰图的情况：

l 熔解曲线是平滑尖锐的单峰；

l 熔解曲线峰值对应产物Tm值*；

l NTC对照不起峰。

*由于盐离子浓度不同等原因，不同公司的反应试剂所得的熔解曲线峰值可能略有偏差。

理想，是丰满的~

可现实中，你的熔解曲线是否是这样的？

这样的？

或是这样的？

关于熔解曲线，最常见的问题就是双峰或乱峰。造成熔解曲线双峰或乱峰的原因多样，通常为引物二聚体或非特异性扩增、模板存在gDNA污染、试剂及环境被污染等。

但是，具体是什么原因造成的呢？NTC反应可以帮助我们判断哦！

NTC与熔解曲线

NTC为不含模板对照（No Template Control），即反应体系中包含除模板以外的所有反应组分。借助样品反应孔和NTC反应孔的扩增曲线差异，可判断是否存在由于引物二聚体或PCR反应产物引起的污染。

熔解曲线可以检验扩增反应的特异性，因此是染料法qPCR实验的必需步骤（非常重要！！！）。借助熔解曲线，我们可以检查qPCR反应体系是否存在非特异性扩增、引物二聚体或气溶胶污染等。

关于qPCR实验，受方方面面的误差影响真不少，一款优秀的试剂，更是qPCR反应成功的关键要素。