摘 要： 建立超高效液相色谱-串联质谱法测定鹿骨胶中阿胶特征多肽含量。样品经酶解、过滤后，采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱分离，以体积分数为0.1%的甲酸溶液作为流动相A，乙腈作为流动相B进行梯度洗脱，在电喷雾离子源正离子模式及多反应监测模式下进行扫描检测，以色谱峰面积为标定量。结果表明，驴源多肽A1、驴源多肽A2的质量浓度分别在20.69~517.26、20.48~511.95 ng/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均不小于0.999，样品的平均加标回收率分别为91.4%、99.3%，测定结果的相对标准偏差分别为1.7%、3.0%（n=6）。该方法准确度高、稳定性好、灵敏度高、专属性强，适用于胶类产品的质量控制。

关键词： 超高效液相色谱-串联质谱法； 鹿骨胶； 阿胶特征多肽

 

动物胶类药物在很多疾病的治疗和保健中具有重要作用。古籍《五十二病方》记载以胶治疗疾病的应用[1-2]，《本草拾遗》[3]、《本草纲目》[4]、《本草求真》[5]等许多古籍中也均有以胶类入方治疗疾病的记载。近年来，关于胶类药物的相关研究逐渐增多，应用领域不断扩展。鹿骨胶是通过煎煮和浓缩鹿骨制成的固体胶。其制法为将鹿骨洗净，浸泡数日，除尽附着的筋肉，截断，经热碱水处理除去油脂，再洗净，加水煎煮共计3次，每次持续8 h，过滤，将滤液合并，加明矾适量，打循环搅拌，静沉，再过滤，将滤液浓缩提抹，加阿胶5%，搅匀，再浓缩成稠膏状，冷却后切块并阴干，即可得到成品。鹿骨胶的质量标准收载于《部颁标准中药成方制剂》十二册WS3-B-2424-97，检测项目包括水分、总灰分及重金属等指标。通过检验项目无法判定鹿骨胶中是否加入了5%的阿胶。由于不同物种蛋白质的氨基端序列存在差异，所以可通过鉴别胶原蛋白序列的差异来追溯物种的来源[6]。KUMAZAWA等[7]采用液相色谱-质谱联用技术，对皮革中的胶原蛋白特征多肽进行鉴别，结果显示只有羊的特征性多肽具有特异性。石峰等[8]利用胰蛋白酶对阿胶样品进行酶解后利用超高效液相色谱-三重四级杆质谱对阿胶专属性特征多肽进行检验，结果检测的10批阿胶样品均检出驴皮特征多肽，证明该方法可用于阿胶中驴皮源性成分的鉴别。《中华人民共和国药典》2020年版一部[9]中收载有阿胶，对阿胶的特征性指标-驴源性特征多肽进行鉴别。另文献有报道用超高效液相色谱-串联质谱[10-14]方法，将样品酶解处理后，检测胶类产品中的杂皮源成分及投料含量[15-19]。

笔者建立超高效液相色谱-串联质谱法测定鹿骨胶中阿胶特征多肽含量，根据测定数据计算出鹿骨胶中阿胶的添加量，适用于鹿骨胶产品及其他含有阿胶成分产品的质量控制。

 

1、 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱仪：6460 Triple Quad型，安捷伦科技(中国)有限公司。

电子天平：Sartorius CPA225D型，感量为0.01 mg，赛多利斯科学仪器(北京)公司。

电热鼓风干燥箱：GZX-9140MBE型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

超声波清洗器：KQ-500B型，昆山市超声仪器有限公司。

高速多功能粉碎机：SL-200型，浙江省永康市松青五金厂。

针式滤膜：PES型，0.22 µm，天津市津腾实验设备有限公司。

超纯水系统：SMART-N型，力康生物医疗科技控股有限公司。

驴源多肽A1对照品：质量分数为92.5%，批号为112040-202102，中国食品药品检定研究院。

驴源多肽A2对照品：质量分数为95.3%，批号为112041-202102，中国食品药品检定研究院。

胰蛋白酶：生化级，批号为SLCM5418，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

乙腈：质谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

甲酸：色谱纯，国药化学试剂股份有限公司。

碳酸氢铵：优级纯，国药化学试剂股份有限公司。

鹿骨胶样品：山东宏济堂制药集团股份有限公司。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱仪

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱[50 mm ×2.1 mm，1.8 µm，安捷伦科技(中国)有限公司]；柱温：30 ℃；进样体积：5 µL；流动相：A相为体积分数为0.1%的甲酸，B相为乙腈；洗脱方式：梯度洗脱，流量为0.3 mL/min，洗脱程序见表1。

表1   梯度洗脱程序

Tab. 1   Gradient elution program

 

1.2.2 质谱仪

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描模式：正离子模式；数据采集模式：多反应监测扫描(MRM)；离子源温度：300 ℃；离子化电压：4 000 V；压力：207 kPa。目标物的选择反应监测质谱参数见表2，理论板数按驴源多肽A1计算应不小于4 000。

表2   选择反应监测质谱参数

Tab. 2   Parameters of selective reaction monitor

 

1.3 溶液制备

1.3.1 样品溶液的制备

将鹿骨胶样品使用高速多功能粉碎机粉碎，精密称取粉碎后的样品粉末0.1 g，置于50 mL容量瓶中，加入40 mL 1%(质量分数)的碳酸氢铵溶液，使用超声波清洗器(功率250 W，频率40 kHz)超声处理30 min，直至样品全部溶解，用1%的碳酸氢铵溶液定容，摇匀。精密量取摇匀后的溶液1 mL，置于5 mL容量瓶中，加入1 mL胰蛋白酶溶液(取生化级胰蛋白酶适量，加1%的碳酸氢铵溶液，制成浓度为1 mg/mL的溶液，临用新制)，再加1%的碳酸氢铵溶液定容，摇匀。将该混合溶液置于设定温度为37 ℃的电热鼓风干燥箱中，恒温酶解12 h。酶解结束后，补加液体并摇匀，过0.22 µm聚醚砜滤膜，取续滤液，得样品溶液。同法制备空白溶液、阴性样品溶液。

1.3.2 混合对照储备液的制备

精密称取驴源多肽A1、驴源多肽A2对照品适量，加入1%的碳酸氢铵溶液，配制成质量浓度为1 µg/mL的混合对照储备液。

1.3.3 系列混合标准工作溶液的制备

用移液管精密量取混合对照储备液1、2、5、10、20、25 mL分别置于50 mL容量瓶中，加1%的碳酸氢铵溶液定容，配制成质量浓度为20、40、100、200、400、500 ng/mL的混合标准工作溶液。

1.3.4 混合对照溶液的制备

精密量取混合对照储备液10 mL置于50 mL容量瓶中，加入1%碳酸氢铵溶液定容至标线，制备得到混合对照溶液。

1.4 实验方法

分别精密吸取不同浓度的系列混合标准工作溶液与样品溶液各5 µL，在1.2仪器工作条件下，以目标物峰面积为纵坐标，目标物质量浓度为横坐标，拟合标准曲线，外标法定量。

 

2、 结果与讨论

 

2.1 色谱的优化

2.1.1 色谱柱的选择

分别考察了RSLC 120 C18 (100 mm ×2.1 mm，2.2 μm)、ZORBAX SB C18 (100 mm ×2.1 mm，1.8 μm)、ZORBAX Eclipse Plus C18 (50 mm ×2.1 mm，1.8 μm)3种不同色谱柱，并比较驴源多肽A1、驴源多肽A2在3种不同色谱柱上的色谱保留情况。结果表明，RSLC 120 C18柱色谱峰分离效果较差，ZORBAX SB C18和ZORBAX Eclipse Plus C18柱色谱峰对称性良好，色谱柱系统适用性均符合要求，但在2种色谱柱中驴源多肽A1、驴源多肽A2的色谱峰保留时间不同，最终选择保留时间较短的ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱。

2.1.2 流动相的选择

液相色谱-质谱联用体系中常采用甲酸溶液和乙腈作为流动相。甲酸有助于提高检测灵敏度，减少峰形变形和分裂，提高分离度；乙腈能够有效分离和洗脱各种化合物，具有优良的溶解性能和极性调节能力。选择0.1%甲酸和乙腈作为流动相，通过调整流动相比例实现流动相的优化。分别考察了两种流动相比例，分别为0.1%甲酸-乙腈(95∶5，体积比，下同)、0.1%甲酸-乙腈(97∶3)，0.1%甲酸-乙腈(97∶3)理论板数和分离度明显高于甲酸-乙腈(95∶5)，因此选择0.1%甲酸-乙腈(97∶3)作为流动相。

2.1.3 质谱条件的优化

驴源多肽A1、驴源多肽A2混合对照品进样检测，通过一级全扫描找到驴源多肽A1、驴源多肽A2的母离子，再分别以一级母离子通过二级全扫描找到二级碎片离子，通过不断优化碎裂电压、碰撞能量、驻留时间以及离子源参数，使碎片离子响应不断增大，最后确定最适合的质谱参数。

2.2 系统适用性

取对照品溶液，在1.2仪器工作条件下连续进样5次，计算对照品溶液连续进样5次的色谱峰面积。系统适用性试验结果见表3。由表3可知，驴源多肽A1、A2对照品峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.3%、0.9%(n=5)。理论板数按驴源多肽A1计算均不小于4 000，分离度均大于1.5，信噪比大于10，表明系统适用性试验符合要求。

表3   系统适用性试验结果

Tab. 3   Results of system applicability test

 

2.3 专属性试验

在1.2仪器工作条件下，分别测定空白溶液、阴性样品溶液、鹿骨胶样品溶液、混合对照溶液，色谱图如图1所示。从图1中可以看出，空白溶液、阴性样品溶液无色谱峰，说明对鹿骨胶样品中驴源多肽A1、驴源多肽A2色谱峰无干扰。并且鹿骨胶样品溶液中驴源多肽A1、驴源多肽A2色谱峰及与其他杂峰之间分离度均大于1.5，表明该方法专属性强。

 

图1   空白溶液、阴性样品溶液、混合对照品溶液、样品溶液色谱图

Fig. 1   Chromatogram of blank solution，negative sample solution，mixed reference solution and sample solution

 

2.4 线性方程与检出限

按照1.3.3方法配制标准曲线溶液。分别精密吸取不同浓度的标准曲线溶液各5 µL，在1.2仪器工作条件下，以对照品峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标制备标准曲线，从标准曲线读出样品溶液中相当于驴源多肽A1和驴源多肽A2的量。质量浓度的线性范围、线性方程、相关系数、检测限及定量限见表4。

表4   质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检测限及定量限

Tab. 4   Linear range of mass concentration，linear equation，correlation coefficient，detection limit and quantitation limit

 

由表4可知，驴源多肽A1、驴源多肽A2的质量浓度分别在20.69～517.26、20.48～511.95 ng/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均不小于0.999。

2.5 样品加标回收与精密度试验

精密称取6份同一浓度样品，分别加入25 µg/mL的驴源多肽A1、驴源多肽A2混合对照溶液1 mL，制成6份加标溶液，每份平行测定2次。分别精密吸取不同浓度的系列混合标准工作溶液与6份加标溶液各5 µL，在1.2仪器工作条件下进样测定，计算驴源多肽A1和驴源多肽A2的加标回收率及相对标准偏差，考察方法的准确度，加标回收与精密度试验结果见表5。由表5可知，驴源多肽A1、驴源多肽A2的平均回收率分别为91.4%、99.3%，测定结果的相对偏差(RSD)分别为1.7%、3.0%(n=6)。表明该方法准确度良好。

表5   加标回收与精密度试验结果

Tab. 5   Results of spiked recoveries and precision test

 

3、 结语

 

建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定鹿骨胶中阿胶特征多肽含量。优化了色谱、质谱条件，并分别从系统适用性、专属性、精密度、准确度等方面进行方法学研究。该方法准确度高、专属性强、检测灵敏度高，对企业鹿骨胶产品生产过程的质量控制具有重要作用，同时也为含有阿胶成分产品的质量控制和质量评价提供参考。

 

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引用本文： 余彩娟，刘册家，杨光霞，等 . 超高效液相色谱-串联质谱法测定鹿骨胶中阿胶特征多肽［J］. 化学分析计量，2024，33（11）： 97. (Yu Caijuan, Liu Cejia, Yang Guangxia, et al. Determination of Asini Corii Colla characteristic polypeptides in Deer Bone Gelatin by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(11): 97.)