核苷酸具有提高人体免疫力、促使细胞再生与修复等生理功能，对人体生长发育有一定促进作用。核苷酸包括嘌呤和嘧啶两类核苷酸化合物，它们在细胞中物质生化合成、能量供给、DNA和RNA合成和必需辅酶产生等一般生理代谢中起着关键作用，它们具有不同能量消耗、能量保存与物质补偿途径，嘌呤核苷酸主要从核苷碱基获得补充，嘧啶核苷酸主要是从核苷获得补偿。由此可见，核苷酸被认为是一类重要的功能食品有效因子成分，在膳食补剂食品奶粉中添加核苷酸及核苷成为国际共识。目前美国和欧盟规定婴幼儿奶粉中5种核苷酸（CMP、UMP、GMP、IMP 、AMP）的含量标准，美国规定奶粉中核苷酸的含量上限为16mg/100 kcal,欧盟规定的含量上限为5mg/100 kcal。我国也在现行的国家标准GB14880-2012《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》中规定了允许使用量为0.12-0.58g/kg（以核苷酸总量计）。

目前，我国已发布的核苷酸检测方法为GB5413.40-2016《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定》，该标准采用高效液相色谱技术检测核苷酸的分析方法，样品基质对液相色谱检测干扰比较大，文献报道也有一些检测方法，如荧光法、高效毛细管电泳法、高效液相色谱法、离子色谱法、液相色谱-质谱法等，除了质谱方法，现有方法不太成熟，样品处理过于复杂，各有缺陷。

本文研究利用高效液相色谱-质谱/质谱联用技术的高灵敏度和抗干扰能力等特点，在一定程度上消除了机制干扰，且样品前处理方式较为简单，可同时快速筛选和确证婴幼儿配方奶粉中的5中核苷酸。通过实际样品检测，验证了该方法的有效性。

1 实验部分

1.1仪器和试剂

高效液相色谱仪U-3000（赛默飞世尔科技ThermoFisher Scientific公司）；三重四级杆质谱仪TSQQUANTIVA，配ESI源（赛默飞世尔科技ThermoFisher Scientific公司）；KQ-700DE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）

胞嘧啶核苷酸（CMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、次黄嘌呤核苷酸（IMP）、鸟嘌呤核苷酸（GMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP）标准品，购于Sigma公司；乙腈和甲酸（色谱纯）购于德国Merck公司；实验所用水为纯水机（Milli-Qintegral 3）制备的超纯水（电阻率18.2MΩ.cm）。

1.2标准溶液的配制

分别准确称取经纯度折算后的适量标准物质（精确到0.1mg），用超纯水稀释，难溶的标准品，加少量甲酸溶解，再用超纯水定容至刻度，配制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备溶液。于4℃以下避光保存。准确吸取标准储备液0.5 mL于10 mL 容量瓶中，用超纯水定容至刻度，标准溶液浓度为50.0 mg/L。使用前用初始流动相将混合标准溶液稀释成系列标准工作液。

1.3样品前处理

称取1.0 g均匀样品（精确至0.01 g），加30mL 水，振荡、超声至完全溶解，转移50 mL容量瓶中，定容至刻度。取5mL 试样于50 mL离心管，加入150µL 1%甲酸溶液，超纯水定容至刻度线，置于超声波清洗器中超声波提取10 min后，在4℃下离心20 min (转速10000 rpm)。吸取上清液，用0.22 μm有机滤膜的一次性滤头过滤，待液相色谱-质谱仪测定。

1.4仪器条件

色谱柱：AgilentZORBAX SB-Aq，3.0*100mm（i.d.），1.8μm；流动相：A,0.1%(v/v)甲酸水溶液；B，乙腈。梯度洗脱程序：0.0-4.0min，99%A；4.0-5.0min，10%A；5.1-7.0,99%A。流速：0.25mL/min；柱温：30℃；进样体积：10μL；分析时间：7 min。

质谱条件：ESI源，多反应监测（MRM）正离子模式；电喷雾电压：3200V；鞘气：40 Arb；辅助器：8Arb；离子传输管温度：350℃；碰撞气：氦气。其他质谱参数见表1。

表1五种核苷酸在MRM模式下检测的质谱参数

Table 1  MS/MS parameters for 5 nucleotides in MRM mode

*：定量离子对（quantitativeion）

2 结果和讨论

2.1蛋白质沉淀方法优化

检测乳粉中核苷酸含量的检测方法主要考虑既能将样品中蛋白质分离出去，又能将核苷酸无损失的提取出来；通常都采用水提取核苷酸，蛋白质的沉淀方法主要有乙酸、甲酸、高氯酸、三氯乙酸等酸沉淀法、乙酸锌+亚铁氰化钾盐沉淀法以及氯仿有机溶剂沉淀法。在实验中发现高氯酸沉淀方法核苷酸损失较大、氯仿沉淀法核苷酸回收率比较低，亚铁氰化钾可能存在重金属离子对质谱仪器的损耗，所以主要探讨了乙酸、甲酸与三氯乙酸等3种有机酸沉淀方法，根据对上述样品前处理方法的比较发现，甲酸沉淀蛋白方法色谱峰形最好。因此决定采用1%甲酸沉淀蛋白质的样品前处理方法。

实验发现，在称样量为 1 g，用50mL水超声溶解后，取5mL样液，加入1%甲酸溶液沉淀蛋白质，比较了  0.1 mL、0.12 mL、0.15 mL、0.25 mL、1 mL等五种甲酸用量核苷酸的回收率，结果表明，用0.12～0.15 mL甲酸溶液，可有效沉淀样液中蛋白质，所得回收率在80%以上，能满足要求。

2.2液相条件的优化

比较了实验室常用的几根C18色谱柱，ZORBAXSB-Aq，3.0*100 mm（i.d.），1.8μm，Xbridge C₁₈ 100×2.1 mm（i.d），3.5μm，Kinetex XB-C₁₈ 100×2.1 mm（i.d），2.6μm， Atlantis T₃ 100×3.0 mm（i.d），3μm。结果表明ZORBAX SB-Aq，3.0*100mm（i.d.），1.8μm色谱柱分离效果比较好。同时，比较甲酸水溶液与乙腈、甲酸-甲酸铵水溶液与乙腈、甲酸水溶液和甲醇和甲酸-甲酸铵水溶液与甲醇等4种流动相配比，结果发现0.1%甲酸水溶液与乙腈体系，5种核苷酸目标物在正负离子化模式均出峰，最终选择液相流动相条件为下表2：

表2 流动相、流速及梯度洗脱条件

2.3质谱测定条件的优化

首先采用200 μg/L 的核苷酸标准溶液在正离子模式下进行母离子全扫描，确定分子离子，然后分别以分子离子为母离子，对其子离子进行全扫描，选取丰度较强、干扰较小的两对子离子为定性离子。最后以多反应监测（MRM）正离子模式优化各种质谱参数。图1显示了标准品分离情况和按照表1的质谱参数采集的核苷酸定性分析结果。

图1 核苷酸标准品的MRM谱图

Fig.1Chromatograms of nucleotide standards in MRM mode

2.4方法学考察

2.4.1 线性范围

将五种核苷酸的混合标准储备液，依次配置为浓度均为25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 mg/mL、800 ng/mL、1000 ng/mL的系列标准工作液，分别以各分析物的峰面积（Y）和对应的质量浓度（X，ug/mL）进行线性回归计算，得到的线性方程的相关系数见表3。5种核苷酸在各自的线性范围内均呈现良好的线性关系（相关系数r>0.999）。

表3 5种核苷酸的线性方程与相关系数

Table 3 Regression eqations and correlation coefficientsof nucleotide

2.4.2 检出限与定量限

取标准储备液经稀释后测定，以信噪比（S/N）为10时对应的标准溶液浓度为方法定量限，得到5种核苷酸的LOQ分别为CMP 0.4 mg/kg、AMP 0.5mg/kg、UMP3.4 mg/kg、GMP 5.0 mg/kg、IMP 2.6 mg/kg。

2.4.3 加标回收率和精密度

取用阴性基质的奶粉，分别添加3个水平的标准溶液后，按照1.3中的步骤进行除杂和净化，加标水平分别为2.0、5.0、10.0 mg/100g；每个水平平行测定6次以评价方法的准确度。该方法的平均加标回收率和相对标准偏差（RSD）结果见表4。

表4 核苷酸的加标回收率及精密度（n=6）

Table 4 Recoveries and relative standard deviations (n=6)

3 结论

本实验建立了高效液相色谱-质谱-质谱法同时检测乳粉中5种核苷酸的检测方法。样品经1%（v/v）甲酸溶液沉淀蛋白质、脂肪等杂质，高速离心后直接进样。本检验方法前处理过程简便，灵敏度高，定量结果准确，能够满足日常检测需要。