[摘要] 作为一种新兴的治疗方法，寡核苷酸药物（ONTs）在罕见病和某些慢性疾病领域展现出了良好的应用前景和开发潜力。目前，全球范围内已有20种ONTs上市，主要包括反义寡核苷酸（ASO）、小干扰RNA（siRNA）和适配体（Aptamer）等，并有越来越多的ONTs进入临床开发阶段。业界已对ONTs的序列设计、化学修饰和递送系统等积累了较多的经验，但对于非临床安全性评价尚缺乏系统认识，也尚未形成全球监管的一致要求。本文系统调研了ONTs的主要毒性来源及其影响因素，以及美国食品药品监督管理局（FDA）已批准上市的ASO和siRNA药物研究案例，在此基础上阐述了ONTs非临床安全性评价的研究内容、关注要点的一般考虑，以期为我国ONTs的研发提供参考。

[关键词] 寡核苷酸药物；非临床；安全性评价；一般考虑

 

 寡核苷酸药物（oligonucleotide therapeutics，ONTs）通常由20~60个核苷酸组成，主要包括反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）和适配体（Aptamer）等[1]。作为一种新兴的治疗手段，ONTs不仅在罕见病领域展现出良好的应用前景，在其他慢性疾病治疗领域（如高血压和高血脂等）也显示出巨大的开发潜力[2,3]。截至2024年1月，全球范围内已有20种ONTs获批上市，并有越来越多的ONTs进入临床开发阶段[4]。近年来，ONTs在合成工艺方面取得的重大突破也为新的ONTs的研发创造了契机。业界已对ONTs的序列设计、化学修饰和递送系统等积累了较多的经验，但对于非临床安全性评价尚缺乏系统认识，包括研究策略、研究内容和关注点等。

目前，国际上尚未形成统一的用于指导ONTs研发和评价的指导原则。仅日本药品和医疗器械管理局（PMDA）于2020年3月发布了《ONTs的临床前安全性评价指导原则》[5]（下文称日本指导原则）。2024年11月，美国FDA发布了《Nonclinical Safety Assessment of Oligonucleotide-Based Therapeutics》草案，目前正在征求意见。国际人用药品注册技术协调会（The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use, ICH）也启动了与该主题相关指导原则的起草工作。我国尚未发布相关指导原则。本文系统调研了ONTs的主要毒性来源及其影响因素，以及美国食品药品监督管理局（FDA）已批准的ASO和siRNA药物的研究案例，并对ONTs非临床安全性评价的策略、研究内容和关注点进行了概述，以期为我国ONTs的研发提供参考。

 

1.ONTs主要毒性来源和影响因素

ONTs的主要毒性分为两类，即基于Watson-Crick互补配对原则的杂交依赖型毒性和基于化学结构、理化性质和递送载体的杂交非依赖型毒性[6]。杂交依赖型毒性又分为在靶毒性和脱靶毒性，前者由ONTs药理学作用的放大引起，后者由ONTs与靶mRNA序列相似的转录本杂交而产生[7]。杂交非依赖型毒性不依赖于杂交，主要包括补体激活、血小板减少、凝血抑制、免疫刺激和高暴露器官的毒性反应[6,8,9]。

未经化学修饰的寡核苷酸易被广泛存在于细胞外和细胞内环境中的核酸酶降解，与血浆蛋白结合的能力较弱，经肾小球滤过后可被迅速清除，导致其在血浆中的半衰期较短，不利于靶组织分布和药效发挥[10,11]。研究表明，化学修饰如硫代磷酸酯（PS）、2'-O-甲氧基乙基（MOE）可提高寡核苷酸对核酸酶的抗性，增强与血浆蛋白的结合，延长在血浆中的半衰期[12]。因此，与未经修饰的寡核苷酸相比，修饰后的寡核苷酸具有更好的药代动力学和组织分布特征，但也可能带来新的毒性。

此外，给药途径和递送载体也是影响ONTs毒性的重要因素。经脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle，LNP）递送或N-乙酰氨基半乳糖（N-acetylgalactosamine, GalNAc）偶联的siRNA能够实现对肝脏等脏器的高效递送，同时由于在这些组织中的暴露量较高、半衰期相对较长，导致聚集并引起相关毒性反应[13]。

 

2. 已上市ONTs安全性特征

2.1已上市ONTs基本信息概述

截至2024年1月，全球范围内已经批准了20种ONTs上市（表1），其中ASO和siRNA占大多数，主要通过反义机制和适配体机制发挥药理作用。

表1 已批准上市的ONTs基本信息汇总

通用名	商品名	上市时间	药物类型	靶点	临床适应症	给药途径
Fomivirsen	Vitravene	1998	ASO	CMV	巨细胞病毒视网膜炎	ivt
Pegaptanib	Macugen	2004	Aptamer	VEGF	黄斑变性	ivt
Mipomersen	Kynamro	2013	ASO	ApoB	IIa型高脂蛋白血症	sc
Eteplirsen	ExONTys 51	2016	ASO	Exon51	杜氏肌营养不良症	iv
Nusinersen	Spinraza	2016	ASO	SMN2	脊髓性肌萎缩症	itt
Defibrotide	Defitelio	2016	Oligonucleotide	PAI-1+tPA+ vWF	肝静脉闭塞性疾病	iv
Inotersen	Tegsedi	2018	ASO	TTR	遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性	sc
Patisiran	Onpattro	2018	siRNA	TTR	遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性	iv
Volanesorsena	Waylivra	2019	ASO	ApoC3	I型高脂蛋白血症	sc
Golodirsen	VyONTys 53	2019	ASO	Exon53	杜氏肌营养不良症	iv
Givosiran	Givlaari	2019	siRNA	ALAS1	急性肝卟啉症	sc
Viltolarsen	Viltepso	2020	ASO	Exon53	杜氏肌营养不良症	iv
Inclisiran	Leqvio	2020	siRNA	PCSK9	原发性高胆固醇血症或混合性血脂异常	sc
Casimersen	AmONTys 45	2021	ASO	Exon45	杜氏肌营养不良症	iv
Lumasiran	Oxlumo	2021	siRNA	HAO1	原发性高草酸尿症1型	sc
Vutrisiran	AMVUTTRA	2022	siRNA	TTR	遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性	sc
Tofersen	QALSODY	2023	ASO	SOD1	肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）	itt
Avacincaptad  pegol	Izervay	2023	Aptamer	C5	地图样萎缩	ivt
Nedosiran	Rivfloza	2023	siRNA	LDH	原发性高尿酸血症	sc
Eplontersen	Wainua	2023	ASO	TTR	遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性	sc

 

注：“*”表示仅获得EMA批准上市。ivt，玻璃体注射；itt，鞘内注射（intrathecal）。

 

CMV，巨细胞病毒；VEGF，血管内皮生长因子；ApoB，载脂蛋白B；Exon，外显子；SMN2，运动神经元存活蛋白2；PAI-1，纤溶酶原激活物抑制剂-1；tPA，组织型纤溶酶原激活剂；vWF，血管性血友病因子；TTR，转甲状腺素蛋白；ApoC3，载脂蛋白C3；ALAS1，5'-氨基乙酰丙酸合酶1；PCSK9，前蛋白转化酶枯草溶菌素9；HAO1，羟基酸氧化酶1；SOD1，超氧化物歧化酶1；C5，补体蛋白C5；LDH，乳酸脱氢酶。

 

2.2已上市ONTs非临床和临床安全性研究结果及相关性分析

根据FDA审评报告和说明书，本文对FDA已批准上市的ONTs非临床毒性表现和临床常见不良反应进行了汇总（见表2）。ONTs在非临床研究中常见注射部位和高暴露器官的毒性反应，主要表现为注射部位反应、肝脏和肾脏嗜碱性颗粒聚集和空泡化等；并可见药理学相关指标的改变。研究表明，嗜碱性颗粒聚集是寡核苷酸被递送到高暴露器官后，分布到具有吞噬活性的细胞（如肝枯否细胞和肾脏近曲小管上皮细胞）中，经苏木精染色后在显微镜下的表现[14]，免疫组化和电镜观察对该结果进行了确认[13]；各种大小的空泡与嗜碱性颗粒聚集通常发生在胞浆的同一区域，推测空泡的形成与溶酶体中局部高浓度的寡核苷酸引起的渗透不平衡所导致的膜结合的溶质聚集物膨胀有关[15]。

表２　已上市的部分ONTs非临床毒性表现和临床常见不良反应

临床试验中常见的不良反应包括注射部位反应、输液相关反应、肝损伤和肾脏毒性等。通过比较这些ONTs的非临床毒性表现和临床常见不良反应发现，非临床研究较好地预测了多数已批准ONTs出现的临床不良反应。如经玻璃体注射（ivt）的Fomivirsen在非临床和临床研究中均可见眼部炎症；Inotersen在动物和人体中均可见明显的血小板减少；Nusinersen在非临床研究中可见神经元病变，在临床试验出现头痛等不良反应等。值得关注的是，由于非临床安全性试验中所采用的是健康动物且检测手段有限，某些可能在患者中出现的不良反应较难通过动物模型进行预测，需要在临床试验中进一步评估。

综上，ONTs的非临床安全性评价包括对在靶毒性和脱靶毒性的考察，可以对临床不良反应的可能性和风险程度进行预测。

 

3.      ONTs非临床安全性评价研究策略

与其他药物一样，非临床安全性研究贯穿于ONTs药物研发的全生命周期。早期发现阶段进行脱靶效应评估有助于确定成药性好的临床前候选分子；开发阶段进行系统的非临床安全性评价对于优化制剂处方、指导临床给药方案的制定、识别临床不良反应或风险具有重要价值，并有助于提高临床试验申请成功率[7]。因此，制定合理的非临床研究策略至关重要。

 

3.1早期发现阶段进行多层级脱靶效应评估,见图1

 

 

ONTs技术具有广阔的应用前景，但同时也存在一定的脱靶风险，如免疫刺激反应、血小板减少、肝脏和肾脏毒性等。为在早期发现阶段对可能的脱靶毒性进行评价，相关领域专家结合目前ASO的研究现状和趋势提出了一套系统的候选分子多层级脱靶效应评估策略[6]。本文参考上述思路并基于笔者的研究经验总结了在早期发现阶段对不同类型的ONTs候选分子（主要为ASO和siRNA）进行脱靶风险评估的策略。

首先，利用生物信息学工具从全转录组中预测可能与候选分子发生杂交的非目标序列，评估其潜在脱靶风险或筛选出特异性高的候选分子；对于存在与非目标序列发生杂交的候选分子，通过体外试验比较该分子与目标序列和非目标序列的活性差异并确立安全活性窗口；对安全活性窗口较窄的分子进行更全面的风险评估，结合非目标序列的表达水平、生物学功能等评估脱靶效应可能产生的影响，并在后续的动物实验中进行进一步的脱靶风险评估

此外，除了杂交依赖型脱靶毒性外，序列或化学修饰相关的杂交非依赖型毒性也是值得关注的内容。例如，ASO药物的PS修饰本身可刺激免疫和激活补体，而中性骨架则没有这种效应；凝血时间延长和血小板减少等毒性与化学修饰关系不大，更多与核苷酸序列本身相关；高亲和力化学修饰，如锁核酸（locked nucleic acid, LNA）更容易导致肝脏和肾脏的亚急性毒性。因此，在筛选策略上，应该根据候选分子的化学修饰和设计，优先评估与之最相关的潜在脱靶毒性。

3.2开发阶段开展系统非临床研究

对于ONTs，非临床研究的核心目标是全面了解其安全性特征，以支持临床开发和上市。建议参考ICH S6（R1）开展在靶毒性评价；对于脱靶毒性，建议采用生物信息学和人源细胞体外基因表达分析评估杂交依赖型脱靶毒性，参考化学药物的方法评价杂交非依赖型脱靶毒性。非临床评价除了常见的考虑因素（如相关种属选择、给药途径和剂量/暴露量）外，还应关注药理学放大效应和替代分子的应用，毒理学研究需要根据相关适应症或拟定的给药方案进行设计。

目前，我国尚无专门针对ONTs非临床研究的指导原则，可参考ICH M3(R2)等指南并结合ONTs产品特点开展必要的毒性试验。一般来说，对ONTs的监管经验与化学药物相似，主要包括安全药理学、一般毒理学、遗传毒性、生殖毒性、致癌性试验及其他与产品特性相关的毒性试验等。由于ONTs具有某些治疗用生物制品的特征，ICH S6（R1）中的某些建议有助于指导非临床研究的开展。实际试验中，应根据ONTs的序列、化学修饰和制剂处方制定具体的非临床研究策略。此外，对于动物种属的选择是该类药物非临床研究的重要内容，将在第4部分进行详述。

 

4.临床安全性评价研究内容和关注点

4.1动物种属的选择

根据上文所述，ONTs的毒性分为在靶毒性和脱靶毒性。为了全面评价脱靶毒性，建议采用啮齿类和非啮齿类2种动物种属；这2种动物种属中至少有1种具有药理学活性，以便对在靶毒性进行评价[5]。根据实际案例以及日本指导原则，当无药理学相关种属时，可仅在1种动物种属中使用替代分子评价在靶毒性[5]。与替代分子相关的毒理学表现通常包括在靶效应、杂交依赖型和杂交非依赖型脱靶效应。由于序列不同于临床分子，替代分子脱靶效应不代表临床分子的安全性，应注意区分替代分子的在靶毒性和脱靶毒性[5]。

表3对已上市ONTs非临床研究一般毒理学试验所用动物种属进行了汇总。这些药物均在猴体内具有药理学活性，在啮齿类动物中是否具有活性取决于其核苷酸序列。根据各自的药理学活性特点，均采用至少1种相关种属考察在靶毒性，同时选择合适的动物种属评估其脱靶毒性。如Inotersen和Patisiran仅在食蟹猴体内有药理学活性，一般毒性试验中选择食蟹猴作为相关种属考察临床分子的在靶毒性，选择啮齿类动物评估临床分子的脱靶毒性；Lumasiran在啮齿类动物和猴体内均具有药理学活性，选择大鼠和食蟹猴考察了临床分子的毒性特征，包括在靶毒性和脱靶毒性。

综上，ONTs非临床研究应兼顾在靶毒性和脱靶毒性的考察，选择2种动物种属，其中至少在1种动物种属中具有药理学活性。

表3 已上市ONTs一般毒理学试验动物种属汇总

类别	通用名	给药途径	具有药理学活性 动物种属	一般毒理学试验动物种属
				小鼠	大鼠	兔	猴
ASO	Fomivirsen	ivt	兔、猴	√	×	√	√
	Mipomersen	sc	猴	√	×	×	√
	Eteplirsen	iv	猴	√	×	×	√
	Nusinersen	itt	猴	√	×	×	√
	Inotersen	sc	猴	√	√	×	√
	Volanesorsen	sc	猴	√	√	×	√
	Golodirsen	iv	大鼠、猴	√	√	×	√
	Viltolarsen	iv	猴	√	×	×	√
	Casimersen	iv	猴	√	√	×	√
	Tofersen	itt	猴	√	√	×	√
	Eplontersen	sc	猴	√	×	×	√
siRNA	Patisiran	iv	猴	×	√	×	√
	Givosiran	sc	大鼠、猴	×	√	×	√
	Inclisiran	sc	大鼠、猴	×	√	×	√
	Lumasiran	sc	啮齿类、猴	√	√	×	√
	Vutrisiran	sc	猴	×	√	×	√
	Nedosiran	sc	猴	√	×	√	√

 

4.2安全药理学试验

建议参考ICH S7A《人用药物安全药理学试验指导原则》对重要生理功能（如心血管、呼吸和中枢神经系统）的非预期影响进行评价，通常情况下可考虑采用整合试验的方式，而不是开展单独的安全药理学试验。由于ONTs不太可能作用于hERG等离子通道，开展体外hERG试验意义不大[5,16,17]。如果在研发过程中发现了体内心血管相关的风险，可能需要开展针对性的体外研究。

Eteplirsen在相关试验中可见对心血管和神经元的影响，Nusinersen因广泛分布于脊髓和大脑，基于风险考虑，二者开展了单独的安全药理学试验。除Fomivirsen外，已上市的所有ASO和siRNA均开展了安全药理学试验，但并非所有药物均进行了hERG试验（如Givosiran、Inclisiran、Lumasiran、Vutrisiran、Fomivirsen、Nusinersen、Eplontersen未开展该试验）。

4.3单次给药毒性试验

日本指导原则中提及如果可从剂量递增试验、短期剂量范围探索试验、药理学试验或重复给药毒性试验中获得急性毒性信息，可不开展单独的单次给药毒性试验，这与ICH M3 (R2)中的建议一致。ICH S6 (R1)中也提到，作为药理学或动物模型有效性试验的一部分，通过进行单次给药毒性试验可收集到剂量-反应关系的信息。

鉴于ONTs在组织中通常具有较长的半衰期，非临床研究中通常采用较长的给药间隔。Eteplirsen、Inotersen、Golodirsen和Lumasiran等已上市药物均未开展单次给药毒性试验，通过其它相关试验对单次给药毒性进行了评估。

4.4重复给药毒性试验

重复给药毒性试验重点评估ONTs在特定器官的蓄积情况和毒性反应。研究表明，一些经化学修饰、具有抗核酸酶活性的ONTs，长期给药后可能会在特定组织如肝、肾等蓄积并产生毒性反应[18]，非临床研究中常见高暴露靶器官的毒性反应，如肝肾可见嗜碱性颗粒聚集和空泡化等[15]。

大鼠经sc重复给予Lumasiran，在20、50和200 mg·kg-1剂量下均可见肝细胞轻微至重度空泡化，枯否细胞色素轻微增加和/或肝细胞轻度到中度核肿大，肾脏轻微至轻度嗜碱性颗粒和/或少量肾小管细胞空泡化；上述肝脏和肾脏相关改变均为非不良反应。综合死亡率、临床观察、体重、生化指标等各项指标，未见不良反应剂量（NOAEL）为200 mg·kg-1。食蟹猴经sc重复给予Lumasiran，30 mg·kg-1剂量下可见碱性磷酸酶轻微升高，100和300 mg·kg-1剂量下可见肝脏枯否细胞轻微嗜碱性颗粒，由于程度较轻且未见对动物健康状况的影响，NOAEL为300 mg·kg-1。与Lumasiran类似，其它已上市药物的重复给药毒性试验至少采用2种动物种属进行，通过临床病理学、组织病理学和毒代动力学检测，考察在不同剂量下的毒性反应特征和剂量-反应关系。

4.5遗传毒性试验

对于含化学修饰的ONTs，应参考ICH S2 (R1)进行遗传毒性试验。

由于ASO和siRNA药物均进行了不同程度的化学修饰，故已上市药物开展了遗传毒性标准组合试验。调研显示，已上市ONTs在Ames、体外染色体畸变和体内微核试验中均为阴性结果。尽管如此，随着更多新化学修饰方式的引入，尚不能忽视ONTs潜在的遗传毒性风险。某些经降解后可整合入DNA的化学修饰寡核苷酸也可能具有遗传毒性[19]。

4.6生殖毒性试验

建议参考ICH S5 (R3)并结合适应症人群进行ONTs的生殖毒性（developmental and reproductive toxicity，DART）试验。通常，采用啮齿类动物进行生育力与早期胚胎发育毒性（fertility and early embryonic development，FEED）试验和围产期发育毒性（pre-and postnatal development，PPND）试验，采用啮齿类和兔进行胚胎-胎仔发育毒性（embryo fetal development，EFD）试验。日本指导原则建议，当临床分子在啮齿类和兔中无药理学活性时，推荐在啮齿类或兔中采用替代分子进行EFD试验，不推荐在非人灵长类动物中进行EFD试验[6]。如证据权重分析（如作用机制、基因修饰动物的表型数据、同类分子的类别效应等）结果提示供试品存在对生育力或妊娠结局有明显的不利影响，足以提示存在生殖毒性风险，则不需要开展额外的DART试验。关于DART试验的时间安排，参考 ICH M3(R2)。

表4对已上市ONTs DART试验类型和所用动物种属进行了汇总。Inotersen、Volanesorsen和Patisiran 等的相关种属仅为猴，均采用啮齿类动物开展了临床分子和替代分子的FEED和PPND试验；除mipomersen、nusinersen、inotersen、volanesorsen、tofersen、patisiran、nedosiran 、givosiran、inclisiran、lumasiran和vutrisiran同时采用啮齿类和兔开展EFD试验（mipomersen、nusinersen、inotersen、volanesorsen、tofersen和eplontersen采用 Ⅰ/II段生殖试验组合的方式进行评价），其余仅采用啮齿类开展EFD试验。兔EFD试验均采用了临床分子，主要目的可能在于用临床分子在第二个种属中考察因脱靶毒性带来的生殖毒性。考虑到杜氏肌营养不良症（DMD）患者主要为男性，Eteplirsen、Golodirsen和Casimersen一般毒理学重复给药中均未观察到对雄性生殖系统的影响，故均未开展DART试验。Viltolarsen的适应症也为DMD，仅进行了雄性小鼠的FEED试验。

4.7致癌性试验

建议参考ICH S1A、ICH S1B和ICH S1C (R2)评估ONTs是否需要以及如何设计致癌性试验。日本指导原则提出，当由于作用机制（如免疫抑制）存在致癌性担忧，或遗传毒性试验、重复给药毒性试验或杂交依赖型脱靶毒性结果提示存在致癌性担忧，则较难通过致癌性试验排除这种担忧，而是应该在考虑临床风险和获益的情况下适当地传达致癌性风险[6]。

表5对已上市ONTs致癌性试验的完成情况进行了汇总。Eteplirsen、Nusinersen和Lumasiran等在提交上市申请（NDA）时未完成致癌性试验，一方面是因为现有的数据未提示致癌性风险，另一方面是结合临床获益-风险评估认为可将致癌性试验可作为上市后要求；由于Inotersen在肝脏和肾脏中存在高暴露，Patisiran在雄性动物中可见细支气管肺泡腺瘤，在NDA时完成了致癌性试验，其中Inotersen采用了替代分子进行了评价。

4.8局部耐受性试验

需评价品种制剂给药的局部耐受性，可在重复给药毒性试验中伴随，除非有单独开展的理由。FDA批准上市的ONTs均在重复给药毒性试验中伴随考察了对给药部位的耐受性。

4.9免疫毒性试验

某些类型的 ONTs 已知会激活先天免疫系统（如巨噬细胞、组织细胞、补体）。尽管通常无需开展专门的免疫毒性评估，但在一般毒性研究中评估 ONTs 诱导的免疫效应（如细胞因子、补体）可以提供有用的信息。可将免疫毒性试验整合在重复给药毒性等试验中进行评价，相关要求参考ICH S8。

Eteplirsen、Nusinersen、Inotersen和Patisiran在重复给药毒性试验中进行了免疫毒性试验相关指标的检测，如白细胞系相关指标（Eteplirsen和Nusinersen）、C反应蛋白（Inotersen）、α1酸性糖蛋白（Patisiran）、免疫器官（淋巴结、胸腺、脾脏）组织病理学（Patisiran）、免疫细胞表型分析（Eteplirsen和Inotersen）等。

4.10光安全性评价

对于化学修饰的核酸如存在特殊的光安全性担忧，应参考ICH S10进行评价。根据目前已上市产品的文献资料，均未见光安全性相关评价，因此，光安全性评价建议具体情况具体分析。

4.11杂质限度的界定

ONTs的杂质分为寡核苷酸有关物质、有机小分子杂质、残留溶剂和元素杂质。小分子杂质、残留溶剂和元素杂质的评价参考ICH Q3和ICH M7；由于理化性质相似，寡核苷酸有关物质通常难以单独分离，较难参考ICH Q3A进行界定，因此对于该类杂质的安全性评价应基于原料药或制剂的研究结果（如杂质谱、毒性谱等）[5]。关于脱靶毒性的生物信息学分析可用于评估寡核苷酸有关物质的杂交依赖型脱靶毒性，如在生物信息学分析中包含了错配序列，可以假定已对主要寡核苷酸有关物质的杂交依赖型脱靶效应进行了研究。如每种寡核苷酸有关物质的含量远低于活性成分，则评价其杂交依赖型脱靶效应的意义不大[5]。对于ONTs，应尽可能在生产过程中减少杂质的产生，并根据药学和非临床研究数据、文献资料综合评价在人体中的安全性。

在Vutrisiran的非临床研究中，共涉及6批样品，其中3批含特定杂质（＞ 0.1%），NOAEL剂量下的杂质水平支持了临床样品杂质限度的制定。

4.12代谢产物和/或降解产物的安全性

研究显示，天然核苷酸很容易经各种途径清除，不太可能形成反应性中间体或破坏天然核苷酸储库和再循环途径[20]；某些化学修饰，如PS和MOE不产生有毒代谢产物，这可减少对部分ONTs代谢产物的评价需求，而对于新的或不明确的化学修饰，可能需要进行更广泛的代谢研究[7]。因此，对于可被核酸酶降解的天然核苷酸，其代谢产物或降解产物的安全性无需特别关注；但对于含有化学修饰的代谢产物和降解产物，需参考ICH M3 (R2)进行非临床安全性评价。

Givosiran是通过将GalNAc配体与siRNA偶联而实现肝脏特异性递送的siRNA药物，主要化学修饰为PS骨架、2'-氟（2'F）和MOE。试验显示，Givosiran在不同种属血清中的稳定性相似，正义链比反义链更稳定，主要的活性代谢产物为AS(N-1)3’ Givosiran。大鼠（10 mg·kg-1）和猴（30 mg·kg-1）经sc给药后，血浆中唯一活性代谢产物为AS(N-1)3’ Givosiran，暴露量占总物质的百分比分别约为17%和42%；临床试验中，Givosiran以2.5 mg·kg-1每月一次sc给药后，血浆中主要代谢产物为AS(N-1)3’ Givosiran，稳态暴露量占总物质的百分比约为33%。在大鼠和猴重复给药毒性试验中，AS(N-1)3’ Givosiran的系统暴露量显著高于临床剂量下的暴露量（表6）。因此，大鼠和猴重复给药毒性试验充分评价了活性代谢产物AS(N-1)3’ Givosiran的安全性[21]。

表6 非临床和临床试验中Givosiran主要代谢产物暴露情况汇总

 

4.13针对递送系统的评价

对于递送系统制剂，评价ONTs最终制剂的安全性是非常重要的，特别是当采用了LNP等特殊递送系统时。ONTs的递送系统在很大程度上影响着其安全性和有效性，应根据风险等级和已有的信息，采用适当的毒性试验评价ONTs载体材料（如蛋白质、脂质、糖等）的安全性[5]。

Patisiran是第一个批准的LNP包裹的siRNA药物，LNP中含有2种新的成分（DLin-MC3-DMA和PEG2000-C-DMG）。针对该LNP，在支持IND和NDA的研究中分别进行了体外hERG试验、一般毒理学试验、体内微核试验和生殖毒性试验（表7）。

 

5.结语与展望

作为一种新兴的治疗方法，ONTs具有巨大的应用前景，有望在更多的罕见性疾病、心血管疾病、代谢性疾病、传染性疾病和癌症领域展现出临床价值。ONTs的毒性取决于多种因素，如序列设计、化学修饰、给药方案（给药途径、剂量、持续时间）等。最常见的改变是肝脏、肾脏等高暴露组织的病理学变化和免疫反应[6,8,9]。已上市产品的非临床研究较好地支持了临床试验的开展，其非临床研究经验为新的ONTs的开发提供了参考。在深度汇总和解读已上市药物非临床研究案例的基础上，本文根据国外监管机构和寡核苷酸安全工作组（OSWG）发布的相关建议和共识文件[22-24]，对ONTs非临床安全性评价的策略和技术要点进行了阐述：1）在早期开发阶段，开展多层级脱靶效应评估，充分利用生物信息学和体外模型对候选序列进行筛选，评估其与非靶标序列发生互补配对的可能性。2）在开发阶段，分阶段开展支持IND和NDA的一般毒理学试验，并从兼顾在靶毒性和脱靶毒性评价的角度考虑非临床安全性评价试验动物种属的选择；结合供试品结构特点、化学修饰和递送载体开展相应的遗传毒性、生殖毒性和致癌性试验。3）关注对代谢产物、杂质和/或降解产物的安全性评估。通过本文，期望为国内ONTs研发提供参考和借鉴。

随着对非编码RNA的深入认识，预计未来将会有更多类型的ONTs进入临床试验或上市。同时，需要考虑如何应对靶细胞递送不足和脱靶效应等挑战[25]。合理的序列设计、算法、化学修饰和递送载体至关重要，减少脱靶效应和更深入地理解毒性机制有助于避免后期开发过程中的安全性问题，提高开发成功率。此外，新型体外模型的开发有助于提高预测性和敏感度。非临床评价应在遵循指导原则的同时，结合具体产品的特点和临床适应症进行个性化考量。监管机构也在不断积累和完善审评实践，为ONTs的研发提供良好的指引。

 

[参考文献]

[1] ROBERTS TC, LANGER R, WOOD MJA. Advances in oligonucleotide drug delivery[J]. Nat Rev Drug Discov, 2020, 19(10): 673-694.

 

[2] GERTHOFFER W. Epigenetic Targets for Oligonucleotide Therapies of Pulmonary Arterial Hypertension[J]. Int J Mol Sci, 2020, 21(23).

 

[3] KIM S, GRAHAM MJ, LEE RG, et al. Heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF) antisense oligonucleotide protected against hyperlipidemia-associated atherosclerosis[J]. Nutr Metab Cardiovasc Dis, 2019, 29(3): 306-315.

 

[4] EGLI M, MANOHARAN M. Chemistry, structure and function of approved oligonucleotide therapeutics[J]. Nucleic Acids Res, 2023, 51(6): 2529-2573.

 

[5] PMDA. The guideline for the non-clinical safety evaluation of oligonucleotide therapeutic products, 2020.

 

[6] GOYENVALLE A, JIMENEZ-MALLEBRERA C, VAN ROON W, et al. Considerations in the Preclinical Assessment of the Safety of Antisense Oligonucleotides[J]. Nucleic Acid Ther, 2023, 33(1): 1-16.

 

[7] YOUNIS HS, TEMPLIN M, WHITELY LO, et al. Overview of the Nonclinical Development Strategies and Class-Effects of Oligonucleotide-Based Therapeutics[J]. A Comprehensive Guide to Toxicology in Nonclinical Drug Development (Second Edition), 2017: 737-754.

 

[8] HENRY SP, GEARY RS, YU R, et al. Drug properties of second-generation antisense oligonucleotides: how do they measure up to their predecessors?[J]. Curr Opin Investig Drugs, 2001, 2(10): 1444-1449.

 

[9]HENRY SP, BEATTIE G, YEH G, et al. Complement activation is responsible for acute toxicities in rhesus monkeys treated with a phosphorothioate oligodeoxynucleotide[J]. Int Immunopharmacol, 2002, 2(12): 1657-1666.

 

[10] ALHAMADANI F, ZHANG K, PARIKH R, et al. Adverse Drug Reactions and Toxicity of the Food and Drug Administration-Approved Antisense Oligonucleotide Drugs[J]. Drug Metab Dispos, 2022, 50(6): 879-887.

 

[11]LEVIN AA, YU RZ, GEARY RS. Basic principles of the pharmacokinetics of antisense oligonucleotide drugs[M]. Basic Principles of the Pharmacokinetics of Antisense Oligonucleotide Drugs, 2007.

 

[12] ECKSTEIN F. Phosphorothioate oligodeoxynucleotides: what is their origin and what is unique about them?[J]. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2000, 10(2): 117-121.

 

[13]JANAS MM, HARBISON CE, PERRY VK, et al. The Nonclinical Safety Profile of GalNAc-conjugated RNAi Therapeutics in Subacute Studies[J]. Toxicol Pathol, 2018, 46(7): 735-745.

 

[14] MONTEITH DK, HORNER MJ, GILLETT NA, et al. Evaluation of the renal effects of an antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide in monkeys[J]. Toxicol Pathol, 1999, 27(3): 307-317.

 

[15] HENRY SP, JOHNSON M, ZANARDI TA, et al. Renal uptake and tolerability of a 2'-O-methoxyethyl modified antisense oligonucleotide (ISIS 113715) in monkey[J]. Toxicology, 2012, 301(1-3): 13-20.

 

[16] STANSFELD PJ, SUTCLIFFE MJ, MITCHESON JS. Molecular mechanisms for drug interactions with hERG that cause long QT syndrome[J]. Expert Opin Drug Metab Toxicol, 2006, 2(1): 81-94.

 

[17] KIM TW, KIM KS, SEO JW, et al. Antisense oligonucleotides on neurobehavior, respiratory, and cardiovascular function, and hERG channel current studies[J]. J Pharmacol Toxicol Methods, 2014, 69(1): 49-60.

 

[18] SHEN X, COREY DR. Chemistry, mechanism and clinical status of antisense oligonucleotides and duplex RNAs[J]. Nucleic Acids Res, 2018, 46(4): 1584-1600.

 

[19] BERMAN CL, BARROS SA, GALLOWAY SM, et al. OSWG Recommendations for Genotoxicity Testing of Novel Oligonucleotide-Based Therapeutics[J]. Nucleic Acid Ther, 2016, 26(2): 73-85.

 

[20] GRIFFEY RH, GREIG MJ, GAUS HJ, et al. Characterization of oligonucleotide metabolism in vivo via liquid chromatography/electrospray tandem mass spectrometry with a quadrupole ion trap mass spectrometer[J]. J Mass Spectrom, 1997, 32(3): 305-313.

 

[21] LI J, LIU J, ZHANG X, et al. Nonclinical Pharmacokinetics and Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion of Givosiran, the First Approved N-Acetylgalactosamine-Conjugated RNA Interference Therapeutic[J]. Drug Metab Dispos, 2021, 49(7): 572-580.

 

[22]  CAPALDI D, TEASDALE A, HENRY S, et al. Impurities in Oligonucleotide Drug Substances and Drug Products[J]. Nucleic Acid Ther, 2017, 27(6): 309-322.

 

[23] HIRABAYASHI Y, MAKI K, KINOSHITA K, et al. Considerations of the Japanese Research Working Group for the ICH S6 & Related Issues Regarding Nonclinical Safety Assessments of Oligonucleotide Therapeutics: Comparison with Those of Biopharmaceuticals[J]. Nucleic Acid Ther, 2021, 31(2): 114-125.

 

[24] TESSIER Y, ACHANZAR W, MIHALCIK L, et al. Outcomes of the European Federation of Pharmaceutical Industries and Associations Oligonucleotide Working Group Survey on Nonclinical Practices and Regulatory Expectations for Therapeutic Oligonucleotide Safety Assessment[J]. Nucleic Acid Ther, 2021, 31(1): 7-20.

 

[25] FRIEDRICH M, AIGNER A. Therapeutic siRNA: State-of-the-Art and Future Perspectives[J]. BioDrugs, 2022, 36(5): 549-571.