自从1985年FDA批准了第1个用于抗肾移植排异反应的鼠源单克隆抗体muromonab-CD3后，单克隆抗体药物已经越来越广泛地用于包括癌症和自身免疫性疾病等多种疾病的治疗。在过去30多年间，单克隆抗体药物的研发进入了快速发展的阶段，仅2016年就有7种单克隆抗体(atezolizumab，olaratumab，reslizumab，ixekizumab，brodalumab，bezlo—toxumab和obiltoxaximab)药物被FDA批准上市。毫无疑问，治疗性单克隆抗体药物是当今生物制药领域发展最快的领域。

单克隆抗体药物研发中也存在诸多问题，其中包括单克隆抗体药物的贮存稳定性问题。单克隆抗体类药物为多结构域蛋白，与传统小分子药物相比，在贮存过程中容易发生聚集和降解等现象，会造成药品批间差异增大以及免疫原性改变等不良后果。通过合理设计制剂处方来稳定单克隆抗体是制药下游工艺中提高药物稳定性的重要方法，能达到增强单克隆抗体稳定性、降低聚体形成的目的。

1、单克隆抗体药物

1.1 单克隆抗体结构特征

单克隆抗体为多IgG，包括2条轻链和2条重链，轻链包括1个可变区(VL)和1个恒定区(CL)，重链包括1个可变区(VH)和3个恒定区(CHl，CH2，CH3)。轻链和重链靠CHl和CL之间的二硫键连接，其中轻链的VL，CL及重链的VH，CHI组成Fab片段。VH和VL各包含3个互补决定区(complementarity．deter．mining regions)CDRl，CDR2，CDR3，这3个CDR组成单克隆抗体的抗原结合部位，能够识别特异的抗原表位。重链的CH2和CH3构成Fc能够决定抗体在血清中的半衰期，并介导免疫反应，如激活补体依赖细胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC)、介导细胞毒性作用(antibody-dependent cell—mediated cytotoxicity，ADCC)、细胞吞噬作用(anti—body-dependent cellular phagocytosis，ADCP)等。人体内有4种不同的IgG亚群(IgGl，IgG2，IgG3，IgG4)，其主要区别在于CHl和CH2之间的铰链大小、链内二硫键连接位置及数目。IgG不同亚群之间不仅结构不同，功能上也有区别。目前已上市的单克隆抗体药物亚型包括IgGl，IgG2或IgG4，这3类IgGs的Fc段能与Protein A结合，在实际生产中便于抗体纯化。相较于IgG2和IgG4，IgGl能够更加高效地介导ADCC和CDC作用。这些复杂的分子结构特征及其功能决定了其要维持抗体的稳定性，必须要考虑到处方成分和相应作用。

1.2 单克隆抗体作用机制

单克隆抗体能通过多种不同的机制达到治疗目的。已上市的单克隆抗体类药物中，靶向表皮生长因子信号通路的抗体，通常是通过直接靶向表皮生长因子受体，造成信号阻断(如cetuximab)，对肿瘤的生长起抑制作用。而另一些通过靶向B细胞／B细胞恶性肿瘤中表达的CD20的单克隆抗体(如rituximab)则是通过介导CDC，ADCC来介导靶细胞死亡。此外，还有一部分抗体能够调控免疫反应(如PD—L1抗体)，增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。现将部分已上市单克隆抗体的类型、作用机制及其制剂处方等内容进行总结(见表1)。

上述作用机制和对疾病疗效作用的实现，需要依赖于抗体结构维持区和功能区的完整性和特异性等。在生产过程中，还需要考虑将中间品、原液和制剂置于适当的处方、保存容器以及保存条件中，才能起到有效地保护这些结构和功能的作用，避免在此生产过程中丧失或不可逆的改变。通过筛选合理的制剂处方，可以适当提高单克隆抗体类药物在生产及贮存过程中的稳定性。总结已上市单克隆抗体的制剂处方，除活性成分外，按照处方成分的功能主要可以分为表面活性剂、赋形剂、离子类辅料、抗氧化剂以及其他成分。

2、制剂处方中各组分的作用

2.1 表面活性剂的作用

由于单克隆抗体具有双极性，其疏水结构域容易结合到水-气界面，进而发生聚集，从而造成药物活性降低或引起免疫原性改变。表面活性剂通常由离子或是极性高聚物构成的亲水头和一条脂肪链组成的疏水尾部构成。根据表面活性剂头部的性质可将其分类为阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂。制剂中常用的表面活性剂是非离子型表面活性剂，因此该类表面活性剂低毒性且对电解质不敏感，有利于单克隆抗体的稳定。表面活性剂稳定蛋白主要有2个机制：①表面活性剂特异性定位到水-气界面，以防止蛋白吸附。②表面活性剂与溶液中的单克隆抗体结合，稳定单克隆抗体，以防止药物之间相互作用。有些表面活性剂通过上述1种机制来维持单克隆抗体稳定性，而有些表面活性剂则通过综合2种机制来维持单克隆抗体稳定性。贮存过程中，药物稳定性除受到气一液界面影响外，还受到固-液界面的影响。由于单克隆抗体表面带有电荷，因此单克隆抗体药物可能吸附到带电荷的包材内表面，这种吸附一方面会降低药物浓度，另一方面吸附在包材内表面的单克隆抗体会形成聚集体。表面活性剂能够改变单克隆抗体与包材内表面的相互作用。

单克隆抗体药物制剂中常见的表面活性剂是聚山梨酯20和聚山梨酯80，表面活性剂的加入，能降低搅动、摇晃、冻融及冻干过程中蛋白的聚集，防止蛋白被吸附到容器表面。聚山梨酯20和聚山梨酯80的区别主要在于脂肪酸侧链的结构，脂肪酸侧链长度及饱和程度不同导致聚山梨酯与蛋白的亲和度不同。对于同一种聚山梨酯而言，其稳定蛋白的能力与其浓度有关，有研究者发现在特定制剂处方中聚山梨酯20浓度高于0．002 5％时能够抑制由晃动所引起的蛋白聚集，低于该浓度的聚山梨酯20则不能降低由摇晃所引起的蛋白不稳定。

在制剂中加入表面活性剂时，一方面应该考虑其对单克隆抗体的稳定作用，另一方面不能忽视其可能带来的不稳定因素。聚山梨酯80在高温时会发生自氧化反应，从而产生过氧化氢，而过氧化氢可能会导致单克隆抗体药物发生氧化。研究表明IL-2中加入聚山梨酯80能明显降低摇晃引发的蛋白聚集，但是聚山梨酯80却在贮存过程中以温度依赖的形式加速IL-2蛋白聚体的形成，该研究可为抗体制剂处方研究及制剂储存条件的选择提供借鉴。

2.2 赋形剂的作用

糖及多元醇(如山梨醇)能通过降低蛋白质药物的聚集，从而达到稳定单克隆抗体药物的目的，因此被用作单克隆抗体制剂中的赋形剂。

高温会导致蛋白变性，从热力学的角度考虑是因为高温下蛋白能够获得自由能，当能量增大到能跨越1个结构域的折叠能级时，会导致蛋白构象由天然构象转变为部分去折叠构象，当2个这种去折叠的分子相互碰撞时，在水分子的环境中易于形成双分子聚集状态。早在20世纪80年代，就有关于溶液中糖对蛋白热力学的改变机制研究，糖之所以能维持蛋白的稳定性，是因为向溶液中加入糖后，糖会与蛋白相互作用，进而增加蛋白表面积，这会抑制蛋白与溶剂之间的自由能交换。若制剂条件不利于单克隆抗体药物稳定性时，蛋白表面结合的糖更容易先被除去，这有利于天然蛋白构象的维持。

除了能够在高温条件下稳定单克隆抗体以外，糖类赋形剂还能在冻融过程中稳定单克隆抗体。实际生产中原液通常要冻存。原液冷冻及融化过程如果不均匀，那么单克隆抗体药物会处于一种浓度和热力学梯度中，靠近冰的单克隆抗体会因为吸附在冰表面导致构象改变。因为糖类在冻存过程中不宜形成结晶，因此糖类赋形剂可以作为低温保护剂稳定蛋白构象。不同种类的糖形成结晶的能力不同，蔗糖和海藻糖均为非还原双糖，由于己糖环的构象灵活性高于戊糖灵活性，因此海藻糖的构象灵活性高于蔗糖，更易与水形成氢键，而蔗糖更容易形成分子内氢键。相比于蔗糖，海藻糖-水系统更均质，当浓度达到33％一66％(w/w)时，海藻糖分子可以形成较大的互联集簇。基于上述理化性质，在冷冻玻璃态下，海藻糖更容易与蛋白分离，从而失去对蛋白的保护作用，因此在-20℃条件下冻存时，蔗糖能比海藻糖起到更好的保护作用。而海藻糖的理化特性能够使高浓度的蛋白包装在其集簇中形成纳米团簇，从而以稳定的胶体形式存在，据报道当蛋白浓度高达320 mg·mL“时，仍可以纳米团簇的形式显示出平衡的流体动力学直径而不会凝结。此外，山梨醇也被用于制剂中作为赋形剂，但有研究表明山梨醇会持续结晶，因此有人质疑山梨醇是否能在冻存条件下稳定单克隆抗体。

除了糖类能够作为赋形剂以外，氨基酸或氨基酸盐也能作为赋形剂。氨基酸可以通过与抗体蛋白间的相互作用或水化作用稳定抗体，具体情况需要根据氨基酸种类以及抗体分子本身的特性决定。与糖类相比，氨基酸的化学特性更加复杂，在制剂处方中除了做赋形剂外，还有其他作用。已上市的单克隆抗体制剂处方中常含组氨酸，组氨酸除了能作为赋形剂以外，因其含有咪唑基团，在pH 5-8的范围内能起到较好的pH缓冲作用。此外，组氨酸能结合如Cu2+和Fe2+等易催化抗体蛋白发生氧化修饰的离子，因此组氨酸还能起到抗氧化剂的作用。

在制剂中添加赋形剂，一方面可以稳定制剂，另一方面赋形剂也会与制剂中的其他组分作用，反而降低药物稳定性。制剂中的还原糖会导致蛋白的伯胺发生糖化反应。糖化修饰对单克隆抗体药物的影响机制目前尚未完全揭示，已知在风湿性关节炎患者的体内出现了由晚期糖化修饰的抗体所诱发的免疫反应。需要注意的是某些糖虽然不是还原糖，但在一定条件下可以转化为还原糖。蔗糖在酸性条件下会水解产生还原糖，因此制剂中蔗糖含量的确定需要十分谨慎，通常pH值>6的制剂中蔗糖不会发生水解，但是若溶剂中含有易于结晶的盐，会导致制剂的pH值大幅下降。此外，制剂处方中添加糖类会增加制剂的黏度，制剂黏度的增大不利于生产及药物的实际使用，如灌装过程中若制剂黏度过大会造成灌装速度降低以及药液倒挂在容器中的现象。

2.3 离子的作用

单克隆抗体药物一般同时含有疏水性基团和亲水性基团，因此溶液中的蛋白在高浓度下可能形成某些可逆的聚体，但随着浓度的增加或是时间的延长，分子间可能形成二硫键，从而导致了不可逆聚体的形成。对于单克隆抗体药物来说，IgG分子间通过Fc片段的疏水结构域相互作用被认为是高浓度下引发聚体形成的主要原因，阴离子能够与蛋白表面的阳离子残基结合，因此能够避免蛋白之间形成阳离子一订键，从而稳定蛋白。聚体间的亲和力依赖于溶液中离子强度及离子种类。在特定的pH值下，阴离子抑制蛋白聚体形成的能力取决于其可以离子化的数量。

2.4 抗氧化剂的作用

生产及贮存过程中与产品直接接触的金属材料，可能造成单克隆抗体发生金属催化的氧化修饰，进而造成蛋白稳定性降低。制剂处方中添加乙二胺四乙酸(ethylene diamine tet．raacetic acid，EDTA)可以鳌合金属离子，有效降低金属催化的氧化反应。甲硫氨酸能够有效降低自由基，减少氧化剂(如过氧化氢)的浓度，从而降低单克隆抗体的氧化反应。此外，光照也会造成某些抗体发生氧化修饰，抗体除了在避光条件下保存以外，可以填充氮气，减少制剂包装中氧气在光线作用下产生的单线态氧，进而降低制剂在光照条件下被氧化的可能性。

2.5 其他组分的作用

近年来，随着给药途径及用药需求的改变等，制剂处方中除了活性成分以外还出现了一些功能性处方成分，如可用于降解透明质酸或扩张血管等作用的组分。透明质酸酶已经被用作处方成分添加到rituximab等抗体中，用于皮下给药。由于细胞外基质的存在，药物的流动性受到控制，一般情况下皮下给药体积不能超过1-2 mL，多于这个体积会造成组织形变并引起疼痛。该问题的解决策略之一是通过在处方中添加透明质酸酶，将组织间的透明质酸分解，使给药体积提高至>2～3 mL。类似于透明质酸酶的功能性处方成分，在进行处方筛选时应该既考虑功能性处方成分与活性物质之间的相互影响，又考虑在贮存过程中两者分别的变化。此外，对于大分子功能性组分还应该注意其可能引入的免疫原性。

2.6 制剂处方的确定

制剂处方中各成分之间、制剂处方成分与单克隆抗体之间都存在非线性的复杂相互作用，单克隆抗体制剂处方的选择具有多样性。以生物类似药为例，抗人肿瘤坏死因子仅(tumornecrosis factor)单克隆抗体adalimumab的原研药为Humira，根据FDA及EMA官网资料显示，Humira制剂处方中的辅料为一水柠檬酸钠、磷酸氢二钠、甘露醇、磷酸二氢钠、聚山梨酯、氯化钠以及柠檬酸钠，而EMA最新批准的由安进公司生产的Hu．mira的生物类似药Amgenvita的制剂处方中使用的辅料为醋酸、蔗糖、聚山梨酯80以及氢氧化钠。虽然两者的制剂处方不同，但Amgenvita仍以生物类似药获批。同样，我国的《生物类似药研发与评价技术指导原则》(试行)中规定生物类似药研发过程中应进行处方筛选研究，并尽可能与参照药一致。对不一致的应有充足的理由。

在制剂处方研发过程中，越来越多的企业运用质量源于设计(quality-by—design，QbD)的理念进行制剂处方的筛选。即首先确定药物的关键质量属性(critical quality attribute，CQA)，然后将可能对关键质量属性造成影响的一系列因素经过合理的设计(如Box-Behnken试验设计)，确定一系列的候选制剂处方，然后对不同候选处方进行稳定性考察，并对稳定性研究的数据进行统计学分析，从而确定处方中不同组分对于药物稳定性影响，进而确定合适的制剂处方。

除了考虑处方中各成分之间的相互作用对单克隆抗体药物的影响外，研发单位还要结合实际生产来确定制剂处方，如生产过程中渗滤、过滤除菌、灌装等操作要求制剂黏度不能过高，因此制剂处方筛选过程中应该考虑适当降低黏度。此外，制剂处方的设计要考虑原液及制剂的包装材料，预填充式注射器中会使用硅油进行内表面处理，硅油不能直接导致蛋白聚集，而是通过在原本单一的水一气界面中又引人了水-油界面，这2个界面的扰动会造成蛋白聚集，为了避免此类情况的发生，可以通过在制剂中添加聚山梨酯20有效降低由硅油引起的蛋白聚集。

3、审评考虑要点

实际生产中由于生产工艺变更、方便贮存等原因，重组单克隆抗体的制剂处方可能发生变更，此外，部分生物类似药研发过程中因为专利问题可能需要研制新的制剂处方。评价某种制剂处方是否稳健需要结合实际生产、储存、运输、临床用药等多种条件下综合考虑，笔者个人认为审评过程中可关注以下几点。

3.1 超滤过高的黏度会增加蛋白从超滤装置中转移的困难，蛋白黏附在超滤装置中，造成蛋白产量降低，如经超滤步骤后，蛋白回收率明显降低，可将制剂处方黏度过大作为考虑的因素之一，同时应考虑蛋白黏附在超滤装置上造成超滤装置的清洁难度提高，进而可能提高共线生产的其他制剂污染的风险。

3.2 冻融实际的生产中，重组单克隆抗体的原液通常是储存于一20℃以下的环境中，待制剂配制前需将原液融化后进入下一步工艺。因此，原液可能存在多次冻融过程，若制剂处方不够稳健很可能造成产品在冻融过程中构象改变。《生物制品稳定性研究技术指导原则(试行)》中规定“对于需冷冻保存的原液、中间产物，应验证其在多次反复冻融条件下产品质量的变化情况”。此外，还应注意的是原液冻融稳定性研究应使用与实际包材相同材质的包装材料，因其不同包装材料在冻融过程中对原液稳定性造成的影响不同。

3.3 装量制剂处方若黏度过大，在灌装过程中可能造成制剂倒挂，因此可能造成装量差异，根据《中华人民共和国药典》2015年版规定，生物制品的装量应该不低于规定量。

3.4 冻干部分重组类单克隆抗体制造过程中采用冻干技术来达到便于储存和运输、延长货架期等目的，但需要注意的是制剂在冻干的过程中会发生pH值改变、离子浓度改变等情况，可能引起产品质量改变，进而影响产品的安全、有效性。因此无论对于新药研发过程中制剂处方的筛选，还是对于液体剂型向冻干剂型的变更，建议关注产品冻干前后聚体含量、产品构象等的变化情况，以确定制剂处方能否适应冻干工艺。

3.5 运输稳定性制剂运输过程中的振动会不停引起新的水-气界面产生，因而可能造成重组单克隆抗体的稳定性降低。《生物制品稳定性研究技术指导原则(试行)》中将振动作为一项影响因素纳入稳定性研究中。振动稳定性除了能模拟运输稳定性外，还能一定程度反映部分重组单克隆抗体类药物(如冻干剂型)在实际使用过程中因抽取造成的稳定性降低的问题。

3.6 直接接触包装材料相容性直接接触生物制品的包装材料可以从多个方面影响重组类单克隆抗体的稳定性，如包材材质不同其产生的影响也不相同，《生物制品稳定性研究技术指导原则(试行)》规定“液体制剂在稳定性研究中还应考虑到产品的放置方向，如正立、倒立或水平放置等”，其中的倒立或水平放置一方面可以考察包材的气密性，另一方面也考虑到橡胶塞与玻璃瓶对产品稳定性影响不同，因此需要分别考察。此外，对于相同材质的包装材料，因其与制剂直接接触的内表面积或形状发生改变，会造成包装系统中的液-固、液一气面积比例发生改变，进而导致制剂稳定性的变化。除包装材料本身会对重组类单克隆抗体的稳定性产生影响以外，包材生产过程的部分残留可能会造成稳定性的改变，部分预充式注射器的针头在制作过程中可能有钨的残留，会导致蛋白聚集，从而引起免疫原性增加，需要引起关注。还应注意的是，直接接触包装材料相容性的研究不仅限于原液及最终制剂的包材，还应考虑需要暂存的中间产物的直接接触包装材料以及生产过程中与药品接触的管道等的相容性。

3.7 临床使用部分重组单克隆抗体类制品在实际使用时是通过静脉给药，使用过程中需要将药物抽取后注入输液袋／输液瓶中用生理盐水等进行稀释后滴注，既涉及重组类单克隆抗体与输液袋／输液瓶的相容性研究，又涉及稀释液可能造成重组单克隆抗体的浓度及整个缓冲液环境改变，此外还涉及实际进行静脉滴注温度与储存温度的差异，所有这些都可能造成制剂稳定性降低。因此为了保证产品的安全性、有效性，可根据产品的实际使用情况进行临床使用稳定性研究。

4、结语

制剂处方的开发是单克隆抗体类药物研发的一个重要环节，相对于化学制剂而言，生物制品的剂型较为单一，相关的研究相对较薄弱。虽然部分国内外企业在单克隆抗体开发过程中已经积累了一定的平台知识，并且已上市产品的制剂处方可作为研发过程的参考，但鉴于单克隆抗体产品及工艺的多样性，且制剂处方作为最终产品的一部分，直接关系到临床用药的有效性和安全性，作者建议研发者在选择制剂处方时应该在充分了解各种处方功能的作用基础上，进行风险评估，并综合考虑产品全生命周期管理的需求，合理选择制剂处方。制剂处方研发过程中应该尽可能多地考虑实际生产、贮存、运输等因素对产品稳定性的影响。

目前，稳定性研究中通常通过纯度、活性等关键质量属性来反映产品的稳定性，未直接对生产及贮存过程中发生的糖化、氧化等翻译后修饰进行研究，但笔者认为进行相关翻译后修饰对产品的影响的研究，有助于企业更好了解产品。生物制剂大多采用冷链贮存，常温贮存有利于降低商业成本，但目前用于常温贮存的制剂处方研发对业界还是一项挑战。此外，未来单克隆抗体用药途径的多样化、复方类单克隆抗体制剂的开发等因素都对制剂处方的研发提出了挑战，制剂处方的开发有待深入研究。