本文主要介绍了武汉艾米森生命科技有限公司研发的医疗器械“SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂盒（荧光PCR法）”的临床前研发实验。

一、SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂盒的产品主要组成成分

表 1 试剂盒主要组成成分

二、SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂盒的产品预期用途

本产品用于体外定性检测人粪便样本中肠道脱落细胞的SDC2 和 TFPI2 基因的甲基化。 

本产品适用于临床医师建议做肠镜检测的患者的辅助诊断，不能作为肿瘤早期诊断或确诊的依据。检测结果仅供临床参考，具体临床应用时，临床医生必须结合病例实际情况判断。 

阳性结果需要进一步接受肠镜检查；阴性结果表示受检者体内有结直肠癌和/或进展期腺瘤的可能性低，但并不能完全排除疾病风险，必要时仍应建议进行肠镜检查。本产品不能替代肠镜，不能用于普通人群的肿瘤筛查。 

三、SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂盒的包装规格

24 测试/盒、48 测试/盒、96 测试/盒。 

四、SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂盒的产品检验原理

本试剂盒采用的技术原理是甲基化特异性多重 PCR-荧光探针法。 

本产品基于实时荧光 PCR 技术实现对粪便样本中 SDC2 和TFPI2 基因甲基化的检测。从人粪便样本中获得肠道脱落细胞基因组 DNA，然后用重亚硫酸盐进行转化，并通过三重 PCR扩增来测定亚硫酸盐转化后的 DNA（bisDNA），从而检测发生甲基化的 SDC2 基因 DNA 片段（ROX 信号通道）和 TFPI2 基因 DNA 片段（FAM 信号通道）以及内控基因 ACTB（VIC 信号通道）。其中 ACTB（β-Actin）基因为常用管家基因，用于评估检测中样本 DNA 含量和质量，在每一次检测中都同时检测阳性对照和阴性对照。 

本试剂盒适用的样本为保存在武汉艾米森生命科技有限公司的细胞保存液中的粪便样本，保存液能有效保护核酸不被降解。粪便样本中特异性核酸提取的原理是利用偶联靶基因探针的磁珠富集相关靶基因。重亚硫酸盐的化学反应把没有发生甲基化的胞嘧啶进行转化，脱氨基反应产生尿嘧啶磺酸盐。转化的原理是亚硫酸盐离子通过亲核反应添加到胞嘧啶上，但是发生了甲基化的胞嘧啶不会被亚硫酸盐转化。本产品对于 SDC2和 TFPI2 甲基化检测，在 SDC2 和 TFPI2 基因启动子与结直肠癌发生高度相关的 CpG 区域，针对经过重亚硫酸盐转化后的序列分别设计了特异性引物和特异性荧光探针，可以在 PCR 反应中专一地检测出甲基化的序列。 

五、SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂盒的主要原材料的选择 

该产品的主要原材料包括：引物、探针、Taq 酶和 dNTP，这些原材料均是通过外购的方式获得。引物和探针均由艾米森自行设计，由合成公司经过合成、修饰和纯化后获得；Taq 酶由原材料供应商克隆表达后获得；dNTP 由供应商化学合成获得。艾米森对主要原材料进行了供应商的选择，通过功能性实验筛选出合格供应商，制定了各主要原材料的技术要求和质量标准并经检验合格。

六、SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂盒的企业参考品和质控品设置情况

该产品企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品、精密度参考品以及检测限参考品。企业参考品的主要原料为粪便样本和细胞系，包括 SDC2基因相应位点甲基化阳性的细胞系、TFPI2 基因相应位点甲基化阳性的细胞系、SDC2 基因和 TFPI2 基因相应位点甲基化阴性的细胞系。这些细胞系均经过数字PCR及Sanger测序方法验证。

阳性参考品包括 10 种，分别命名为阳性参考品 P1-P10，其中阳性参考品 P1-P3 为一定 DNA 浓度下含不同比例甲基化SDC2 基因的单阳样本；P4-P6 为一定 DNA 浓度下含不同比例甲基化 TFPI2 基因的单阳样本；P7-P10 为一定 DNA 浓度下含不同比例甲基化 SDC2 基因和 TFPI2 基因的双阳样本。 

阴性参考品包括 10 种，分别命名为阴性参考品 N1-N10。包括添加 SDC2 基因和 TFPI2 基因甲基化阴性细胞系的粪便样本、添加 SDC2 基因和 TFPI2 基因甲基化阴性且其他消化道易共存基因甲基化阳性细胞系的粪便样本、不同干扰疾病患者粪便样本、含一定浓度不同干扰物质的健康人粪便样本。 

精密度参考品包括 2 种，命名为精密度参考品 R1 和 R2，为一定 DNA 浓度下含不同比例甲基化 SDC2 基因和 TFPI2 基因的双阳样本。 

检测限参考品包括 3 种，分别命名为检测限参考品 L1-L3，其中检测限参考品 L1 为一定 DNA 浓度下含低比例甲基化SDC2 基因的单阳样本；L2 为一定 DNA 浓度下含低比例甲基化TFPI2 基因的单阳样本；L3 为一定 DNA 浓度下含低比例甲基化 SDC2 基因和 TFPI2 基因的双阳样本。 

本试剂盒设置了阳性对照质控品，为一定浓度的阳性 DNA 样本，用于检测过程中试剂和仪器的质量控制；此外，每一个反应中均检测内参基因 ACTB，用于结果的判读及监测样本的质量。

七、SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂盒的生产工艺及反应体系研究 

艾米森对试剂盒反应体系的研究包括引物探针浓度的确定、Taq 酶浓度的确定、dNTP 浓度的确定、PCR buffer 浓度的确定、阳性对照品浓度的确定、单多重体系的验证等；对 PCR反应条件的研究包括预变性时间、退火温度和扩增循环数的优化；对样本的用量以及样本保存时间进行了研究；对检测结果的阈值和基线进行了研究。通过功能性实验，最终确定了最佳的反应体系。 

艾米森根据试剂盒中试剂及组件的主要生产工艺的研究结果，确定了最佳的生产工艺。 

八、SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂盒的分析性能评估研究

该产品分析性能评估内容包括准确度、精密度、分析灵敏度、分析特异性、不同包装规格性能的研究和核酸提取试剂及核酸纯化试剂性能研究，同时对粪便样本稳定性、粪便样本核酸提取液稳定性、粪便样本核酸转化液稳定性进行了研究。 

准确度研究中，艾米森分别用三批试剂盒在三种适用机型上对阴性参考品和阳性参考品进行检测，检测结果显示阴性参考品符合率、阳性参考品符合率均为 100%。同时使用若干临床样本对试剂盒准确性进行了研究，结果显示试剂盒检测结果与Sanger 测序结果一致。 

精密度研究中，艾米森使用不同浓度和不同甲基化比例的临床样本，分别对三批次试剂盒在三种适用机型上由两位操作者在20天进行连续的检测。结果显示试剂盒对临床样本的批内、日内、运行间、批次间、日间、人员间、设备间和实验室间的检测变异系数均小于等于 5%。 

分析灵敏度研究中，艾米森配制不同浓度、不同甲基化比例的模拟样本，每浓度梯度使用三批试剂盒分别在三种适用机型上检测 20 次，将检出率大于等于 95%的最低浓度水平确定为最低检测限；检测限的验证为使用连续生产的三批试剂盒在三种适用机型上对最低检测限浓度水平的临床样本检测 20 次。检测结果显示该产品的最低检测限为1×104 copies/µL野生型DNA背景下 1%的 SDC2 和TFPI2 甲基化 DNA。 

分析特异性研究包含交叉反应研究和干扰研究：交叉反应研究中，用三批试剂盒检测转化前的结直肠癌粪便样本、非目标的其他结直肠癌相关基因甲基化阳性的粪便样本和常见肠道微生物样本，均无交叉反应；用三批试剂盒检测其他恶性肿瘤患者粪便样本，包括胃癌、食管癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、尿路上皮癌、前列腺癌、宫颈癌、甲状腺癌和肺癌共 10 种恶性肿瘤，结果显示，该产品与胃癌、食管癌、胰腺癌、尿路上皮癌、前列腺癌、宫颈癌存在一定的交叉反应，与其他恶性肿瘤无交叉反应。同时进行了风险分析。干扰试验结果显示，粪便样本中分别含有以下干扰物：1.07 mg/mL 布洛芬、1.2 mg/mL 黄连素、12 mg/mL 蒙脱石散、0.27 mg/mL 头孢、2 mg/mL 通便灵、0.04 mg/mL 吗丁啉、0.8 mg/mL 氧氟沙星、0.83 mg/mL 开塞露、4 mg/mL 痔疮膏、0.16 mg/mL 奥美拉唑、4 mg/mL 硬脂酸、2 mg/mL 软脂酸、100 μg/mL 动物 DNA、100 μg/mL 植物 DNA、30 mg/mL 甘油三酯、60 mg/mL 血红蛋白、20 mg/mL 胆红素均不干扰本试剂盒的检测结果。 

使用三批不同包装规格（24 测试/盒，48 测试/盒，96 测试/盒）的试剂盒进行阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、检测限和精密度研究，结果表明，该产品不同包装规格检测结果性能无差异。 

艾米森采用临床粪便样本进行了核酸提取试剂性能研究和核酸纯化试剂性能研究，并根据与该产品的组合性能研究结果，确定推荐的核酸提取试剂和核酸纯化试剂符合检测要求。 

九、SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂盒的阳性判断值或参考区间研究 

该产品阳性判断值的研究采用临床来源粪便样本。474 例样本包括结直肠癌患者样本、进展期腺瘤样本、非进展期腺瘤样本、结直肠息肉样本、结直肠炎症样本、淋巴瘤样本、胃息肉样本、胃炎样本、神经内分泌癌样本、食管瘤样本、痔疮样本、其他消化系统良性疾病样本、肠道无异常样本。 

采用百分位数法确定内标基因的 Ct 值范围，采用 ROC 曲线法确定靶标基因阳性判断值。内标基因 Ct 值≤36 时判定为样本合格；在确定样本检测结果有效的情况下，确定了 SDC2 和TFPI2 基因的 Cutoff 值均为 Ct≤38。当 SDC2 基因和 TFPI2 基因的 Ct≤38 时判断为对应基因阳性；当 SDC2 基因和 TFPI2 基因的 Ct 值＞38 或显示 Unde 时判断为对应基因阴性。样本检测结果中，SDC2 基因和 TFPI2 基因任一基因为阳性则样本为阳性， SDC2 基因和 TFPI2 基因同时为阴性则样本为阴性。 

十、SDC2和TFPI2基因甲基化联合检测试剂盒的稳定性研究

艾米森对该产品的稳定性研究包括货架效期稳定性、开封稳定性、冻融稳定性和运输稳定性。 货架效期稳定性：选择三批次试剂盒置于-20 ℃±5 ℃条件下保存，在效期的第 0、3、6、9、12、13 个月各进行一次检测，对试剂盒外观、企业参考品及阴/阳性对照品检测的结果显示：试剂盒在生产后保存至13个月各项性能指标均符合产品技术要求，产品有效期可达 12 个月。 

此外，艾米森对产品的运输稳定性、开封稳定性等分别进行了研究。结果显示，产品的性能均满足产品说明书的声称。