在统计分析中，当我们需要比较多个组的均值时，多重比较（multiple comparisons）方法用于确定哪些组之间存在显著差异。单因素方差分析（ANOVA）通常用于检测总体差异，而多重比较则用于进一步分析各组之间的具体差异。

多重比较和两两比较的主要区别在于方法和目的：两两比较是逐对比较样本组之间的差异，适用于样本组较少的情况，但可能导致多重检验问题，从而增加整体犯第一类错误的概率；而多重比较通过调整显著性水平来控制整体犯第一类错误率，适用于样本组较多且需要保证结果可靠性的情况。

字母标记法（letter-based method）是一种直观展示多重比较结果的方法，通过为每个组分配字母，表示组间的显著性差异。同一字母表示组间没有显著差异，不同字母表示组间存在显著差异。

1. 多重比较的背景

在进行多个组的均值比较时，例如使用单因素方差分析（ANOVA）后，如果总体的F检验显著，则需要进行后续的多重比较来确定哪些组之间存在显著差异。

2.字母标记法

字母标记法是通过给不同组分配字母来表示组间显著性差异的一种方法。

具体方法如下：

1）将所有平均数按从大到小排列，并在最大的平均数上标注字母a；

2）将该平均数与其余平均数逐一比较，凡差异不显著的，均标记为字母a，直到遇到一个显著差异的平均数，标记为字母b；

3）以标有b的平均数为基准，与所有比它大的平均数进行比较，凡差异不显著的，也标记为字母b；然后，再以标有b的最大平均数为基准，与以下未标记的平均数进行比较，凡差异不显著的，继续标记为字母b，直到遇到一个显著差异的平均数，标记为字母c。

4）具有相同标记字母的平均数之间差异不显著，而具有不同标记字母的平均数之间差异显著。

5）小写字母表示显著水平α= 0.05；大写字母表示显著水平α = 0.01。

3.字母标记法的示例

1）打开Graphpad软件，输入待分析数值

2）点击New Analysis

3）对应column分析选择单因素方差分析，点击OK

4）方差分析参数设置选择多重比较，选择两两之间比较，点击OK

5）这时两两之间的显著性已经被计算出来了，这里的组间差异都是显著的。

6）作图标注字母

a. 首先根据均值大小，将各组由高往低排排序，均值最高的组标注为“a”，即C组均值为80，是三个组里最大的，则C组标“a”；

b. 将均值最高的组与第二高的组相比，若差异显著，则第二组标注为“b”；B组的均值为50，即接下来B和C比，其p=0.0242，差异显著，则B标“b”。

c. 然后以标注为“b”的组的均值为标准，以此类推，继续循环往后比较，直到最小均值的组被标记，且比较完毕为止。此时只有A组未标，A组的平均值为20，B组与A组比较，其p=0.0242，差异显著，即A组标“a”。