摘 要： 建立扩散-吸收提取/离子色谱法检验血中氰化物。取1.0 mL血样置于10 mL顶空瓶中，加入1.0 mL超纯水混匀，再加入0.5 mL浓磷酸，放入装有0.5 mL 0.25% NaOH溶液的2.0 mL进样瓶中，密封后于60 ℃加热40 min，放冷30 min，扩散-吸收完毕后抽取进样瓶内溶液进行分析，安培检测器进行检测，以CN-保留时间定性，以外标标准曲线法定量。氰化物（以CN-计）检出限为0.5 ng/mL，且质量浓度在1～500 ng/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数大于0.99，加标回收率为71.3%～84.8%，测定结果的相对标准偏差均小于5%（n=6）。该方法简便、准确、灵敏度高，可用于血中氰化物的定性定量检验。

关键词： 法医毒物学； 氰化物； 离子色谱； 安培检测器； 扩散-吸收

 

氰化物是广泛应用于工矿业的有毒化学物质，属于剧毒物，是危险化学品之一，包括氰化钾、氰化钠、氢氰酸等无机氰化物和双异氰酸盐、丙烯腈等有机氰化物，此外，桃、杏、枇杷、杨梅、樱桃等核仁及木薯等都含有氰苷，在体内分解也可产生氢氰酸，因此过量食用含氰苷的果仁可引起中毒，与氰化物相关的投毒、中毒案件也偶有发生。氰化物进入人体后，可与线粒体中细胞色素C氧化酶里的Fe3+形成配位键，阻止其还原为Fe2+，使其失去传递电子的能力，细胞无法吸收氧气而导致人体窒息死亡[1]。氰化物中毒血质量浓度约为0.5 μg/mL，致死血质量浓度约为1.0 μg/mL[2]，在体内一般以氰根离子和硫氰酸盐的形式存在。

目前对于氰化物的检测主要有分光光度法[3‒5]、化学法[6‒7]、柱前衍生-气相色谱法/质谱法[8‒10]等检测方法，也有相应的GA/T 930—2011《生物样品中氰离子的气相色谱法和化学检验方法》行业标准，但都存在易被干扰或灵敏度低或操作繁琐等缺点，离子色谱法具有抗干扰力强、高灵敏等优点从而被广泛应用，但研究基质多为水[11‒13]，杂质较少，而且即便有对血液开展的研究，所采用的样品处理方式也要么为乙醇沉淀蛋白[14]，沉淀不完全导致基线不平整，要么采用类似的扩散法[16]，但扩散装置设计复杂、采用导管导入的方式，并且处理过程中要求禁止摇匀，导致回收率不高，为此，笔者研究设计了结构简单、反应空间狭小的扩散-吸收装置，通过加酸后密封加热，使氰化物转化为氢氰酸(HCN)并逸出，再被NaOH溶液吸收，采用高灵敏度ED检测器检测吸收液中NaCN的处理过程，建立了对血液样本中氰化物高选择性、高抗干扰能力、高灵敏度的检验方法，为该类案件的侦破和诉讼提供技术导侦和理论支持。

 

1、实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

离子色谱仪：ICS5000型，配AS-AP自动进样器，美国赛默飞世尔科技公司。

恒温水浴锅：HH-S4型，常州市金坛国胜实验仪器制造有限公司。

涡旋震荡仪：MS3基本型，广州仪科科技有限公司。

超纯水机：Milli-QR型，美国密理博公司。

玻璃顶空瓶：20 mL，带聚四氟乙烯密封盖和铝帽，浙江赛恩斯科学仪器有限公司。

玻璃进样小瓶：2 mL，美国安捷伦科技有限公司。

CN-标准溶液：CN-质量浓度为100 μg/mL，溶剂为0.1 mol/L NaOH水溶液，美国CATO公司。

浓磷酸：质量分数为85%，色谱纯，天津大茂化学试剂公司。

NaOH溶液：质量分数为50%，美国赛默飞世尔科技公司。

乙酸钠：色谱纯，质量分数为99%，美国西格玛公司。

无水乙二胺：分析纯，国药化学试剂股份有限公司。

空白全血：青岛市中心血站。

1.2 标准储备液的配制

将100 μg/mLCN-标准溶液逐步稀释为1.0、0.1 μg/mL的标准工作液，于3 ℃保存，实验中根据需要添加以上两种溶液至测定所需的浓度；将质量分数为50%的NaOH溶液稀释为质量分数为0.25%的NaOH溶液，作为吸收液使用。

1.3 色谱条件

色谱柱：AS7阴离子分析柱(250 mm×4 mm，10 μm，美国赛默飞世尔科技公司)，带AS7阴离子保护柱(50 mm×4 mm，10 μm，美国赛默飞世尔科技公司)、安培检测器；参比电极：Ag/AgCl；工作电极：Ag；柱温：30 ℃；流动相：0.5 mol/L乙酸钠-0.1 mol/L NaOH-0.5%(体积分数)乙二胺，流量为1 mL/min；进样体积：25 μL。

1.4 实验步骤

取0.5 mL吸收液于2 mL进样小瓶中，备用；取1.0 mL血液样品于10 mL顶空瓶中，加入1.0 mL水，再加入0.5 mL浓磷酸，以300 r/min涡旋震荡5 s；再用镊子将进样小瓶快速放入顶空瓶，紧接着用聚四氟乙烯密封盖和铝帽密封顶空瓶；顶空瓶于60 ℃水浴中加热40 min，取出室温放冷30 min；开盖后用针管吸取进样小瓶内液体进行离子色谱分析。注意操作过程中顶空瓶内液体与进样小瓶内液体不要混合。装置示意图见图1。

图1   样品处理装置示意图

Fig. 1   Sample processing device schematic diagram

 

2、 结果与讨论

 

2.1 样品处理条件的优化

采用扩散-吸收法进行提取，将血液样品置于实验室常用的10 mL顶空瓶(外瓶)中，加水进行稀释，便于HCN的逸出，同时使血液内氰化物与浓磷酸的反应更完全，加热时HCN扩散至外瓶上部空间，然后被装有吸收液的2 mL进样瓶(内瓶)吸收，变为不挥发的氰化钠，吸取内瓶氰化钠溶液进行离子色谱分析。这与传统的乙醇沉淀蛋白的方法[14]相比，无干扰杂峰、基线平滑、操作简单。方法使用的吸收液为0.25%（质量分数）的NaOH溶液，换算成物质的量浓度为0.1 mol/L，这与流动相中NaOH的浓度基本一致，可确保出峰更加稳定，且0.5 mL吸收液可完全吸收血液中含量为μg/mL级的氰化物。

试验优化了水浴加热温度、加热时间和放冷时间。取空白血分别加入CN-标准物质工作液适量，配制成10、50、200 ng/mL的添加样本，按1.4方法处理，考察加热时间分别为10、20、30、40、50 min，加热温度分别为40、50、60、70 ℃和冷却时间分别为10、20、30、40 min时的CN-色谱峰面积，以各优化参数下CN-的最大峰面积为100%基准计算其他条件的回收率，以回收率作为评价指标，结果见图2。

图2   不同加热时间、加热温度及冷却时间时的色谱峰面积

Fig. 2   The chromatographic peak area at different heating time， heating temperature and cooling time

由图2可见，(1) HCN沸点较低(只有25.7 ℃)，析出量随着加热温度的升高而增加，60 ℃时析出量达到顶点，之后随着温度的进一步升高，由于部分发生聚合反应呈减小趋势[15]，温度大于80 ℃时血液蛋白会变性凝固，因此未考察80 ℃以上的情况，最终将加热温度设置在60 ℃。(2) HCN析出量随着加热时间的延长而增加，40 min时析出量达到顶点，之后随着时间的延长，由于气密性等问题逐渐降低，综合考虑，将加热时间设为40 min。(3)理论上放冷时间越久，HCN与NaOH吸收液反应越彻底，通过试验发现，30 min时吸收已达饱和，之后基本无变化，故静置放冷时间以30 min为宜。

2.2 血液粘稠度的影响

在极浓、较浓、正常三种不同粘稠程度的血液中分别添加CN-标准工作液，配制成10、80 ng/mL的加标样品溶液，按1.4方法处理，考察了血液粘稠度对HCN逸出效率的影响，不同血液粘稠度是的色谱法面积如图3所示。由图3可见，较浓和正常粘稠度血液的逸出率相差不大，但极浓血液样品的逸出效率比较低，这是因为粘稠度越高，血中的脂肪、磷脂等含量越多，可使红细胞凝聚性增加，会阻碍HCN逸出，因此尽管方法中对血液样品进行了1倍的稀释，但对于极其粘稠的血液来说稀释倍数仍然不够。考虑极其粘稠的血液较为罕见，在满足方法要求的基础上，最终采取1倍稀释的方式。

 

图3   不同血液粘稠度时的色谱峰面积

Fig. 3   Chromatographic peak area at different blood viscosity

2.3 顶空瓶体积的考察

配10、50、200 ng/mL的加标血液样品各两份，分别置于10、20 mL的顶空瓶中，按1.4方法操作，以最大色谱峰面积为100%基准计算回收率，不同顶空瓶体积时的色谱峰面积见图4。由图4可以看出，顶空瓶体积越大，瓶内HCN分散体积越大，相同的进样体积内HCN的含量越低，从而导致回收率降低。由于这两种规格的顶空瓶均为实验室常用，小于10 mL的顶空瓶比较少见，因此在满足实验要求的基础上未考察容量更小的顶空瓶，最终采用10 mL的顶空瓶。

图4   不同顶空瓶体积时的色谱峰面积

Fig. 4   Chromatographic peak areas at different headspace bottle volumes

2.4 内源性氰化物的影响

将10份不同人的空白血、取其中1份正常粘稠度的空白血加CN-标准工作液适量，按1.4方法处理，和空白水、CN-标准工作液一起进样分析，考察色谱峰形、空白血中杂质和内源性氰化物对目标物的影响。图5为CN-的色谱图。

图5   CN-的色谱图

Fig. 5   Chromatograms of CN-

受饮食影响，氰化物作为人体中的内源性物质而普遍存在，据文献报道[16]，203份普通人血中氰化物质量浓度最高值为42 ng/mL，平均值11 ng/mL，白酒中尽管含有微量氰化物(国家规定不大于8 ng/mL)，但有研究发现，196份饮酒血液样本中平均质量浓度为10.2 ng/mL，68份不饮酒血液样本平均质量浓度为13.0 ng/mL，因此饮酒对人体血液中氰化物含量无影响；另外人体血液中氰化物质量浓度吸烟者约为41 ng/mL，不吸烟者约为16 ng/mL[17]，且血液腐败也可产生氰化物[18]。通过图5可以看出，CN-峰形良好(Rt=5.117 min)，不受血液杂质的干扰；空白水中未检出CN-，但空白血中检出了内源性的微量CN-，质量浓度最低约为0.5 ng/mL，最高达58.4 ng/mL，平均为15.9 ng/mL，与报道基本相符，因此在确定最终定量结果尤其是遇到较低质量浓度的样品时，要考虑内源性氰化物对数值的影响。

2.5 标准曲线、线性范围及检出限

取空白血，依次加入CN-标准工作液适量，配制成质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100、200、500 ng/mL的系列标准溶液，按1.4方法处理后进样。

分析系列标准溶液，以信噪比(S/N)为3的质量浓度作为检出限(LOD)，信噪比(S/N)为10的质量浓度作为定量限(LOQ)，测得CN-的检出限和定量限；以CN-色谱峰面积作为纵坐标，CN-质量浓度为横坐标绘图，绘制标准工作曲线，得到的回归方程为y=0.109 2x+0.239 8，r=0.995 75，LOD、LOQ分别为0.5、1.0 ng/mL。

2.6 加标回收与精密度试验

取空白血按1.4方法进行处理分析，记录空白血的色谱峰面积本底值(R0)；配制质量浓度分别为10、50、200 μg/mL的加标血液样品，每种浓度配制6份，按1.4方法处理，分析CN-色谱峰面积(R1)；直接稀释CN-标准工作液至以上浓度，按1.4方法同步操作，记录CN-色谱峰面积(R2)，计算回收率，试验结果见表1。

表1   加标回收与精密度试验结果

Tab. 1   Results of the recovery and the precision test

 

由表1可以看出，方法回收率为71.3%～84.8%，准确度较好；测试结果的相对标准偏差为0.84%～3.09%，精密度较好，符合法庭科学中毒物检测的要求。

 

3、 结语

 

建立了血液中氰化物的离子色谱检测方法，通过扩散-提取的样品处理方式，可准确定性定量，方法操作简便、抗干扰能力强、灵敏度高。经验证该方法的特异性、准确度、精密度、灵敏度、线性和回收率均满足法庭科学中毒物检验的要求，但未考察加大血液稀释倍数对极其粘稠血液回收率的改善，有待继续研究。尽管国家已加大对氰化物的管控力度，但与此相关的中毒也偶有发生，该方法的灵敏度优于行业标准，不仅可用于生物样品中氰化物的检验，在疾控、环境、化工等其他领域也有广泛的应用前景。

 

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引用本文： 吕惊晗，周晋升，宋丽娟，等 . 扩散-吸收提取/离子色谱法检验血中氰化物［J］. 化学分析计量，2024，33（10）：23. (LYU Jinghan, ZHOU Jinsheng, SONG Lijuan, et al. Diffusion absorption extraction/Ion chromatography for the detection of cyanide in blood[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(10): 23.)