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嘉峪检测网 2017-04-25 16:00
大肠菌群卫生学意义
大肠菌群作为粪便污染的指标菌评价样品中是否受到粪便的污染。大肠菌群是理想的粪便污染的指标菌，大肠菌群计数的高低，直接反映了样品受粪便污染的程度。大肠菌群不是细菌学上分类命名，而是一组与粪便污染有关的细菌。它们之间的生化特征及血清学反应并非完全一致。一般认为这群细菌包括：大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌。
标准修订情况
1984年首次颁布 GB/T 4789.3-84《食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定》。1994、2003、2008、2010和2016分别公布新的版本。
目前GB/T 4789.3-2003这一版本还在继续使用。GB/T 4789.3-2003的特点：选取1-2个可疑菌落进行染色和复发酵，挑取菌落数偏低，检验武断性较大。3-5%大肠菌群在EMB上可形成不典型菌落。另一方面，形成典型菌落的也未必是大肠菌群。所以，方法对检验者经验要求比较高。
GB 4789.3-2016 变化及解读
封面
变化：标准删除了标准的英文名称
解读：这是2012年之后的固定做法。
变化：修改了发布单位名称，由“中华人民共和国卫生部”改为“中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会”和“国家食品药品监督管理总局”。
前言
变化：写的比较明确，替代的各标准以及标准的主要变化都写了。
没有写出来的变化是修改了图1 大肠菌群MPN计数法检验程序和样品的稀释方法。
另外以往历次版本全部被删掉了，这点与2010版不同。
1 范围
变化：修改了第二段适用范围： “本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群计数；第二法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群计数”，这里边所谓的含量较高、较低一般以100CFU作为界限。100CFU以上采用第二法，100CFU以下采用第一法。
2 术语和定义
变化：仅仅是把英文名的首字母大写了。
存在的问题：
这其中存在的争议主要是“发酵乳糖产酸产气”中间不需要顿号。
3 检验原理
变化：2016版新增章节。
存在的问题：
3.1 “应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。”这句话有点小问题。建议应该描述为：应用统计学概率推算出待测样品中大肠菌群的最可能数。定义中MPN为最可能数而不是最大可能数。
3.2 平板计数法的描述不像是解释检验原理，因为这句话看起来仅仅是描述形成典型菌落的原理。
4 设备和材料
存在的问题：
4.6只写了振荡器不够，例如冷冻样品化冻需要恒温震荡水浴，梯度稀释最好采用旋涡混合仪；
4.10“pH计或pH比色管或精密pH试纸”中“精密pH试纸”不太好用，对于有颜色样品和有颜色的培养基不允许使用“精密pH试纸”来测量pH，因为会受到基质颜色的干扰影响pH判断。
5 培养基和试剂
变化：将原来每个英文单词大写的首字母，改成了小写。
解读：这才符合英文的习惯用法。
变化：5.6、5.7分别删除了氢氧化钠溶液和盐酸溶液前面的“无菌”两个字。
解读：高压灭菌过程会导致盐酸挥发，并且这两种试剂本来就是无菌状态。
第一法 大肠菌群MPN计数法
方法适用范围：MPN适用于污染比较轻微的样品。对于污染菌量太多的样品，还是平板计数法更有优势；相对于平板计数法来说，检验结果不够准确。
6 检验程序
变化：在图1里面，将LST肉汤初发酵培养时间由48 h±2 h改为24 h～48 h。
解读：这样才跟正文中间规定的两次观察时间能够吻合。
存在的问题：最后一个框图中，报告结果改成了结果报告，还是与其他GB 4789系列标准都是规定为“报告”不一致。
7 操作步骤
变化：7.1.2 增加了“或其它无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇”。
解读：这样的修订，满足了一般实验室常常使用漩涡混合仪等手段混合液体样品的需求。
变化：7.2 在复发酵试验后面增加了“证实试验”四个字。但是后面48 h的那个复发酵试验，又没有增加。
变化：7.3 复发酵试验
增加了“证实试验”作为标题。跟前面对应。
变化：7.4 将确证的大肠菌群LST阳性管数改为BGLB阳性管数。
解读：这样是跟实际操作情况相一致的。
建议：
1）.7.1.1样品的稀释建议大家采用磷酸盐缓冲液作为稀释液，可以认为是商业化培养基并且具有一定的pH调节作用。
常见错误：
1）.7.1.3实验室应有pH调节记录，即使pH不需要调节就在6.5-7.5之间也应有pH检测记录。
2）.7.1.5“……从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。”因为大肠、肠杆菌科等都是20min分裂一次，所以操作一定要在15min之内。
注意事项：
发酵实验判定原则：只要有肉眼可见的气泡就算（包括特别小的气泡）需进行下一步复发酵；试管明显浑浊但无气泡不要着急判为阴性，需每根试管拿起来轻弹看是否有气泡延管壁上行；含有碳酸气的食品需特别注意判断气泡来源，以免造成误判。
第二法 大肠菌群平板计数法
方法适用范围：相对于MPN法，平板计数法检验结果更精确；适合用于污染比较严重的样品，但对于污染菌量太少的样品，还是MPN法更有优势。
8 检验程序
变化：第二法图2第三个框图中，将“接种VRBA平板”修改为“倾注VRBA平板”
解读：这样的描述明显更为明确。
9 操作步骤
9.2 没有改动。
但是有两个遗留问题：
9.2.1“同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿做空白对照。”这里规定使用生理盐水明显不符合实际情况，因为也可能使用磷酸盐缓冲液。应该描述为同时取1 mL无菌稀释液加入无菌平皿做空白对照。
9.2.2 在（VRBA）后面多了一个“约”字。这是2010版本就错误的地方，这次还没有修改。
变化：9.3 增加了“（如菌落直径较典型菌落小。）”和“最低稀释度平板低于15 CFU的记录具体菌落数。”
解读：现在这样的描述当然是更细致了，但是还是缺少平板菌落数超过150 CFU的情况该如何选择的描述。
存在的问题：老问题是CFU这个缩略语出现太突兀，没有说明这个缩略语的含义。
变化：9.4 增加了“少于十个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。”
解读：这个条款的常见问题在于，多数实验室挑取10个典型和可疑菌落的比例，并没有按照在平板上观察到的典型和可疑菌落比例进行，会导致最终换算结果出现大的偏差。
变化：9.5 增加了“若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。”
建议：这里还应该加上，包括证实实验，菌落均不是大肠菌群阳性的。
常见问题：
1）9.3规定“……分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落…”原始记录没有分别记录这两项的都是不符合规定的。
附录
变化：附录A 主要是文本格式修改，把培养基的pH放在制法里面了。
存在的问题：
但是，关于LST肉汤和BGLB肉汤，因为含有乳糖，使用121℃高压15 min是否会分解乳糖导致结果假阳性，还需要进一步证实。
规定VRBA融化并恒温至45℃～50℃倾注平板。按照惯例，45℃温度太低了，琼脂常常部分凝固，描述为46℃～50℃比较合适。
存在的问题：
A.4 磷酸盐缓冲液与前面章节中“5.4 无菌磷酸盐缓冲液”，名字不一致，差了“无菌”两个字。并且跟A.5 无菌生理盐水的写法不一致了。
变化：A.6和A.7试剂名称和制法都有修订，不仅是描述更为准确了，而且删除了必须121℃高压灭菌的步骤，避免了盐酸等腐蚀性化学物质的挥发。
附录B 仅仅有文本格式有修改。
来源：AnyTesting
