背景介绍
神经退行性疾病是一组表现为脑细胞（即神经元）逐渐丧失数量和功能的复杂多样的神经系统疾病。目前全球已有数以百万计的人群深受其害，其中以阿尔兹海默病（Alzheimer’s Diseases，AD）和帕金森病（Parkinson’s Diseases，PD）最为常见。AD的主要疾病特征表现为记忆力减退并伴随有多种其它认知功能障碍（如语言、执行和视觉空间等方面的困难），最终发展为痴呆[1]。研究发现AD患者的大脑海马体和皮质等部位常见受损或死亡的神经元，这被认为与神经元外淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）沉积和神经元纤维（含高度磷酸化的Tau蛋白，p-Tau）缠结密切相关[1,2]。而PD患者则主要有运动迟缓、肌肉僵硬、静息性震颤以及姿势和步态障碍症状，这些特征多数与大脑黑质致密部中产生多巴胺的神经元减少有关[1]。α-突触核蛋白（α-synuclein，α-syn）在神经元内路易小体（Lewy bodies）和路易轴突（Lewy neurites）的异常堆积是PD的主要病理学特征之一[3]。
图1神经退行性疾病的生物标志物[1]
脑脊液和血液生物标志物检测在AD和PD等神经退行性疾病的诊断和治疗中具有重要作用。如脑脊液中Aβ42、总Tau蛋白（t-Tau）和p-Tau在AD的轻度认知障碍期可达到95%以上的灵敏度和特异性，是AD痴呆期的诊断标志物[4]。另外，通过检测脑脊液中α-突触核蛋白也能准确地鉴别和诊断PD患者[1]。同时，多项研究也表明血浆中Aβ42/40、p-Tau（181、217）和神经丝轻链蛋白（neurofilament light，NfL）以及胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）等生物标志物与AD发生发展关系密切，其在替代或补充CSF生物标志物参与AD诊断和治疗方面具有很大潜力[1,4]。但是血脑屏障的存在导致血液中神经退行性疾病生物标志物的超低浓度范围(pg/mL或者fg/mL级别)， 同时血液中大量的基质蛋白（如IgG），可能存在的蛋白酶降解，以及肝脏代谢和肾脏清除作用，均会进一步干扰低丰度靶标蛋白的检测[4]。因此，迫切需要开发出超高灵敏度的检测方法与平台才能进一步满足神经退行性疾病生物标志物的临床检测需求。
超高灵敏度的simoa检测平台
近来，随着超灵敏免疫检测技术的进步，单分子阵列 (SIMOA)法基于数字蛋白的检测原理，灵敏度比传统免疫分析法高1000倍，是目前最灵敏的蛋白检测技术，已成功实现了血液中AB、Tau蛋白和神经丝轻链蛋白 (NfL)的定量检测，具有超高的灵敏度。
表1.从不同平台比较PBMC中提取4种细胞因子水平（包含spike高浓度和低浓度样品及内源性质控样品(EQC，Endogenous quality control)）[5]
Simoa的检测原理：通过磁珠酶联反应与微孔列阵芯片的结合，实现单分子蛋白检测。
图2. Simoa平台的检测原理[6]
1.利用表面标记有捕获抗体的磁珠捕获样品中的抗原；
2.使用Biotin标记的检测抗体对被捕获的抗原进行标记；
3.加入链霉亲和素-半乳糖苷酶复合物，与检测抗体上的Biotin结合；
4.将反应洗净后的磁珠与底物混合，加载到含有微孔阵列的检测芯片中，利用磁场使磁珠落入与其尺寸完全匹配的微孔中，加入油相，使得微孔之间物理隔离；
5.含有半乳糖苷酶的微孔由于酶分子催化底物产生荧光产物；
6.对微孔阵列进行荧光成像，通过对发出荧光信号的微孔个数对照标准曲线实现定量检测。
生物分析策略
生物标志物在药物的开发过程中被科学家和监督机构广泛用于各种目的，但考虑其复杂性，法规部门并没有发布统一的生物标志物方法验证的指南。M10指导法规、中国药典和欧洲药品管理局（EMA）等涉及临床生物分析的法规没有明确针对生物标志物的内容。FDA在2013年的《生物分析验证法规指南》中提到，对于生物标志物可以使用‘fit-for-purpose’的生物分析策略[7]。在最新版的FDA Guidance（Bioanalytical Method Validation, Guidance for Industry, 2018）上，描述为在药物开发过程中，生物标志物可用于各种各样的目的；因此，在确定方法验证的适当范围时，应使用‘fit-for-purpose’分析策略[8]。工业界也发表不少文章来讨论如何进行‘fit-for-purpose’分析验证。2019年Critical Path Institute 发表的“Points to Consider document: scientific and regulatory considerations for the analytical validation of assay used in the qualification of biomarkers in biological matrices”，比较详细描述了如何进行生物标志物的方法或验证[9]。
参考文献
1.Hansson O. Biomarkers for neurodegenerative diseases. Nat Med. 2021 Jun;27(6):954-963.
2.Alzheimer's Association. 2013 Alzheimer's disease facts and figures. Alzheimers Dement. 2013 Mar;9(2):208-45.
3.Spillantini MG, Goedert M. Neurodegeneration and the ordered assembly of α-synuclein. Cell Tissue Res. 2018 Jul;373(1):137-148.
4.Blennow K, Zetterberg H. Biomarkers for Alzheimer's disease: current status and prospects for the future. J Intern Med. 2018 Dec;284(6):643-663.
5.David Yeung, Shawn Ciotti, Shobha Purushothama, et al. Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg/mL levels of cytokines in human serum. Journal of Immunological methods.2016 Aug;S0022-1759(16):30156-9.
6.https://zhuanlan.zhihu.com/p/618477934
7.Draft Guidance for Industry. Bioanalytical Method Validation. US Department of Health and Human Services. 2013.
8.U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Veterinary Medicine (CVM). Bioanalytical method validation, guidance for industry. May 2018.
9.Critical Path Institute. Points to consider document: scientific and regulatory considerations for the analytical validation of assay used in the qualification of biomarkers in biological matrices. Jun 2019.
