摘 要： 优化了虾蛄生物可给性镉检测方法的样品处理条件。运用简单的生物可给性提取技术，参照《中国药典》药物溶出度与释放度、崩解时限检查法，结合膳食摄入水平，以虾蛄为研究对象，探讨了料液比、模拟人工胃液pH值、消化时间等参数对检测结果的影响，采用响应面法对虾蛄生物可给性镉的最佳消化条件进行了优化，建立了相应的检测模型。结果表明，料液比为0.5 g/mL，人工胃液pH值调至1.1，消化时间2 h，消化温度为（37±1） ℃时，生物可给性镉检测效率最高。优化后的虾蛄生物可给性镉检测方法为实现重金属人体生物可给性实验方法的标准化提供了一种解决方案。

关键词： 虾蛄； 镉； 生物可给性； 人工胃液

 

虾蛄，别称口虾蛄、皮皮虾、虾爬子等，是一种多年生大型底栖甲壳类动物，因其营养丰富、肉质鲜美而深受人们喜爱。近几年，虾蛄中频繁检出镉(Cd)，引起人们对其食用安全的担忧。镉是一种在生命系统中积累的有毒重金属，具有一定的致癌和致突变性，易通过食物链进入人体并造成严重危害[1‒2]。镉在生物体内的半衰期长达10～30年，是已知的最易在生物体内蓄积的污染物之一[3]。

镉在生物体内有多种存在形式，包括可溶性的无机镉、有机镉和不溶性的矿物盐类镉等。由于不同形态的镉没有统一规范的检测方法，目前食品安全国家标准均以总镉含量作为检验和判定指标。然而，食物中的镉被人体摄入后，首先要经口腔胃肠液消化溶出(这部分镉称为生物可给性镉)，然后才能穿过肠壁进入体循环产生危害(这部分镉称为生物有效性镉)。食物中的总镉并不能完全被人体吸收。因此以总镉含量评估食品中镉的毒性往往会放大镉的毒性效应，以生物可给性镉和生物有效性镉作为评价指标可以实现更准确的风险评估。笔者探讨了一种基于人体生理特点的虾蛄最大生物可给性镉的检测方法，以实现对虾蛄中镉的更准确的风险评估。

检测食品中重金属生物可给性的常用方法是体外消化模拟实验[4]。徐笠等[5]对几十年来体外消化法研究进行梳理总结出目前主要有8种源于国外的体外消化方法，分别是PBET法、RIVM法、TIM法、DIN法、SBET法、IVG法、SHINE法、UBM法。这些方法模拟的器官包括口腔、胃、小肠、大肠等，考虑了不同pH、料液比、不同成分消化液、不同停留时间、不同消化环境以及不同空腹和饱腹状态等因素，每一种方法均有其理论基础和应用范围。李娜等[6]发现不同模型对不同重金属元素的生物可给性的结果也有差异。目前，体外消化方法类型的选择和设计主要取决于研究者的研究目的和意图，尚无规范统一的重金属生物可给性检验方法。这8种体外消化方法中，SBET法属于简单生物可给性提取法，只考虑胃消化作用。由于胃液极低的pH值可以最大程度地溶出重金属，更适用于风险评估结果，因此该方法被英国地质调查局[7]和美国环保局采纳用于土壤重金属的风险评估[8]。

笔者参考侧重于风险评估的简单生物可给性提取法(SBET)，用符合人体生理特点的盐酸人工胃液替代该方法模拟胃液中添加的非人体内环境常规成分氨基乙酸。考虑到人体摄入食品和药品后有相同的代谢环境，借鉴《中华人民共和国药典(2020年版)》(以下简称为《中国药典》)中关于药品溶出度与释放度、崩解时限等分析方法[9]，结合食品摄入习惯，对消化时间、pH值、振荡频率、料液比进行单因素试验和响应面试验，得出最佳优化后的胃液消化提取条件，探讨了一种借鉴《中国药典》和SBET提取法，经优化后进行虾蛄最大生物可给性镉的检测方法。

 

1、 实验部分

 

1.1 主要仪器和试剂

原子吸收分光光度计：ICE 3500型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

微波消解仪：TOPEX型，上海屹尧仪器科技发展有限公司。

高速冷冻离心机：ST 16R型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

数显恒温水浴振荡：HH-4型，精度为±1 ℃，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。

高速分散器：T 18型，德国IKA公司。

电子天平：QUINTIX124-1CN型，感量为0.1 mg，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

镉标准溶液：1 000 μg/mL，标准物质编号为GBW08612，中国计量科学研究院。

虾中镉质控样品：编号为P99856B，镉质量分数为（0.110±0.025） mg/kg，广州谱恩科学仪器有限公司。

磷酸二氢铵：分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司。

硝酸：电子UP级，成都市科隆化学品有限公司。

盐酸：优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

胃蛋白酶：猪胃粘膜，UPS级，活性为1∶3 000，上海博湖生物科技有限公司。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 微波消解条件

微波功率：1 800 W；升温程序：80 ℃，保持时间3 min；100 ℃，保持时间2 min；120 ℃，保持时间3 min；150 ℃，保持时间3 min；180 ℃，保持时间3 min；200 ℃，保持时间30 min。

1.2.2 石墨炉工作条件

石墨管：涂层石墨管；校正背景：塞曼；检测波长：228.8 nm；灯电流：4 mA；通带：0.5 nm；氩气流量：0.2 L/min；升温程序：以10 ℃/s升温至100 ℃，保持30 s；以150 ℃/s升温至800 ℃，保持20 s；升温至1 400 ℃，保持3 s后停气检测；2 500 ℃，保持3 s。

1.3 溶液制备

稀盐酸：按《中国药典》规定方法配制，取盐酸234 mL，加水稀释至1 000 mL，即得。HCl体积分数为9.5%～10.5%。

盐酸人工胃液：按《中国药典》0 921附注，取稀盐酸16.4 mL，加水约800 mL与胃蛋白酶10 g，摇匀后，加水稀释成1 000 mL，根据需要调整pH值。

1.4 实验方法

1.4.1 样品处理

分别从4个市地的10家农贸市场及渔市码头随机采集海捕野生虾蛄样品，去掉头部，手工剥去外壳，取肌肉组织匀浆，于-18 ℃下冷冻，备用。

1.4.2 总镉实验方法

称取1.4.1匀浆液1.0 g (精确至0.000 1 g)，加入8 mL硝酸，在1.2.1仪器工作条件下进行微波消解，赶酸后用1%(体积分数，下同)硝酸溶液定容至20 mL，为样品消化液。按1.2.2设定石墨炉工作参数，其他按照GB 5009.15—2014《食品安全国家标准　食品中镉的测定》进行，测定并计算总镉含量。同时做空白和实物质控样品。每个样品进行3次测定。

1.4.3 生物可给性镉实验方法

称取1.4.1解冻后混匀的虾蛄匀浆液1.0 g(精确至0.000 1 g)，置于15 mL离心管中。加入2.00 mL盐酸人工胃液(料液比为0.5 g/mL)，置于（37±1） ℃水浴中，振荡频率为100 次/min，消化2 h，取出冷却至室温，定容至10 mL。再将其置于提前预冷的4 ℃冷冻离心机中，以10 000 r/min离心20 min。取上清液1 mL，按1.4.2进行实验，检测生物可给性镉。同时做空白和实物质控样品。每个样品平行测定3次。

1.4.4 单因素试验

通过单因素试验，主要研究料液比、pH值、消化时间和振荡频率4个因素对生物可给性镉含量影响。

1.4.5 响应面试验

在单因素试验的前提下，使用Design-Expert 13.0软件进行响应面试验，响应面水平因素表见表1，研究A (消化时间)、B (pH)和C (料液比)3个因素对生物可给性镉含量的影响。

表1   响应面水平因素表

Tab. 1   Table of response surface level factors

 

 

 

2、 结果与讨论

 

2.1 单因素试验参数优化

结合《中国药典》中影响药物溶出度和释放度及崩解时限的参数，并考虑成人每餐食物摄入量400～700 g[10]，每日摄入饮用水1 500 mL，胃液每日分泌1 000～2 500 mL[11]，研究消化时间(0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0 h)、振荡频率[30、50、70、90、110、130、150次/min (往复振荡)]、pH (1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)、料液比(4.00、3.00、2.00、1.00、0.50、0.33、0.25 g/mL)4个因素对生物可给性镉含量的影响，结果如图1所示。

 

图1   各因素对生物可给性镉含量的影响

Fig. 1   Influence of various factors on cadmium bioaccessibility content

 

从图1中可以看出，随着消化时间延长，镉溶出的含量逐渐上升并趋于平衡，在达到3 h时后逐渐平稳，因此选择消化时间2、3、4 h进行响应面试验。振荡频率对镉含量结果基本无影响，因此忽略此因素。pH值越大，镉的溶出越低，pH在1.0时生物可给性镉含量最高，结合人体实际情况，选择pH值1.0、1.5、2.0进行响应面试验。料液比在2.0 g/mL之后，镉的溶出值增加，在0.5 g/mL之后逐渐平稳，因此选择料液比2.0、1.0和0.5 g/mL进行响应面试验。

2.2 响应面法试验参数优化

2.2.1 响应面试验结果

根据单因素试验结果设计响应面实验，单因素试验结果表明，振荡频率对镉溶出没有影响，选择消化时间、料液比、pH值进行3因素3水平响应面试验。料液比2.0、1.0、0.5 g/mL，分别用用料含量0.667%、0.500%、0.333%代替。响应面试验设计分析表见表2。

表2   响应面试验设计分析表

Tab. 2   Response surface experiment design analysis table

注：料液比2.0、1.0、0.5 g/mL，分别用用料质量分数0.667%、0.500%、0.333%代替。

 

对表2的数据进行拟合，得到的生物可给性镉含量模型方程见式（1）。

 

（1）

该模型方程的回归分析和变异系数分析见表3。由表3可知，该试验的模型P值小于0.01，说明该模型达到极显著水平；失拟项的P值为0.521 9，说明失拟项不显著，拟合方程可以达到目的。因素B的P值小于0.01，说明消化液pH对镉含量的影响极显著，因素C用料含量P小于0.05，说明料液比对镉含量也有显著的影响，而消化时间影响则不显著。通过比较分析，在影响生物可给性镉含量的因素中，其影响因素从大到小顺序依次为消化液pH、料液比、消化时间。

表3   回归模型分析表

Tab. 3   Regression model analysis table

注：1）A—消化时间，B—消化液pH，C—用料含量：2）P＜0.01极显著差异，标注为**；P＜0.05显著差异，标注为*。

 

经统计分析，该模型决定系数R2为0.918 5，说明该模型能解释91.85%的响应结果变化，其拟合度良好，误差小，能较好地分析预测生物可给性镉含量；变异系数CV为9.84%，小于10%，说明此研究具有较高的可信度和精确度；该模型精密度结果为9.471 8，大于4，说明该模型可预测，因此该模型对生物可给性镉适应性较好。

2.2.2 交互因子效应分析

根据所得的回归方程分析2个因素之间的交互影响，得到交互因子的响应面和等高线图，如图2～图4所示。响应面的陡度或平缓度可以反映出试验条件变化对响应值的影响，等高线形状可以反映相互作用强度，等高线呈椭圆形，则2个因素之间相互作用强烈；圆形则表明2因素之间交互作用较弱；等高线排列越紧密，表明对试验结果影响越大。从图2～图4中可以看出，所有响应面图都呈现良好的抛物线形状，表明各因素都有明显的相互作用，且每个曲面图的开口都向下，证明试验结果具有最大值。因此各因素水平范围内可以确定最优的参数组合。

图2   消化时间和pH对生物可给性镉含量的影响

Fig. 2   Effect of digestion time and pH on cadmium bioaccessibility levels

 

 

图3   消化时间和料液比对生物可给性镉含量的影响

Fig. 3   Effect of digestion time and material-liquid ratio on cadmium bioaccessibility content

 

 

图4   pH和料液比对生物可给性镉含量的影响

Fig. 4   Effect of pH and material-liquid ratio on cadmium bioaccessibility content

 

2.2.3 响应面法最佳参数验证和结果质控

试验采用Design-expert13.0软件进行优化，最终优化参数为消化时间2.018 h，pH值1.100，用料含量为0.345%，生物可给性镉含量最佳响应预测结果为4.392 mg/kg，根据实际情况，调整参数为消化时间2 h，pH值1.1，料液比0.5 g/mL，实际检测值为4.452 mg/kg，与预测值相差0.06 mg/kg，说明该模型误差小。按照该模型对28个虾蛄样品进行生物可给性镉检测，虾蛄镉的生物可给率为26.4%～78.6%。已有研究表明，贝类、缢蛏、蛤仔、鲍鱼、牡蛎、小龙虾的生物可给性镉在28.6%～87.7%之间[12‒17]，两者数据接近，表明本研究模型具有可行性。

按1.4.2操作，虾蛄质控样镉检测结果为0.114 mg/kg，符合质控样品要求(0.085～0.135 mg/kg)；所有试验3次测定结果的相对标准偏差为0.8%～7.2%(n=3)，均小于10%；空白试验结果均小于检出限。表明该方法准确度较高。

2.3 生物可给性镉检测方法标准化可行性探讨

经优化后得到的生物可给性镉消化模型为：配制pH 1.1盐酸人工胃液作为消化液，按照料液比0.5 g/mL，消化温度（37±1） ℃，消化时间2 h，进行虾蛄镉溶出。该模型完全结合人体生理特点，简单易行。该方法与现有研究采用的口腔胃肠液全仿生消化方法相比，胃液成分、pH值、料液比、消化时间更接近人体生理特点，节省了口腔肠道消化步骤。有研究表明，水产品镉的溶出大部分在胃消化阶段[18‒19]。郝春莉等[20]研究了模拟胃、肠道消化液中类金属硫蛋白(MT-like)对镉的结合作用，发现经过肠道中性环境后，肠道MT-like蛋白能与胃液溶出的镉大量结合，反而使暴露在体内的生物可给性镉降低。笔者所建方法经优化后可以最大程度地溶出镉。其检测数据可最大化镉的生物可给性，为基于虾蛄生物可给性镉的膳食暴露风险评估提供依据。

 

3、 结语

 

笔者结合《中国药典》、中国居民膳食摄入水平和胃液分泌量，经参数优化后确定了料液比0.5 g/mL，pH值1.1人工胃液，消化时间2 h的虾蛄中最大生物可给性镉简单消化模型，再按照GB 5009.15—2014《食品安全国家标准　食品中镉的测定》对提取出的生物可给性镉进行检测，并对该模型方法进行了可行性验证。该方法为食品中重金属的生物可给性试验方法的标准化研究提供了一种解决方案，为基于人体生物可给性的食品中重金属的风险评估提供了一种便捷途径，为基于食品中重金属生物可给性的风险评估提供了一种理论依据。

 

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