1、基毒杂质的定义

 

基因毒性杂质(Genotoxic Impurity，GTI)：是指能直接或间接损伤细胞DNA，产生致突变和致癌作用的物质。

 

潜在基因毒性杂质(Potential Genotoxic Impurity，PGI )：是指具有警示结构，但尚未经实验证实具有遗传毒性的杂质。

 

此处，咱们简单延伸说下基毒杂质是如何损伤DNA，导致突变和致癌的。

 

首先基毒杂质的作用对象是DNA，即脱氧核糖核酸。它带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。

 

DNA 分子结构中，两条多脱氧核苷酸链围绕一个共同的中心轴盘绕，构成双螺旋结构。脱氧核糖-磷酸链在螺旋结构的外面，碱基朝向里面。两条多脱氧核苷酸链反向互补，通过碱基间的氢键形成的碱基配对相连，形成相当稳定的组合。如下图：

脱氧核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。其中碱基有4种：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。四个碱基中有很多的亲核位点，比如嘧啶环和嘌呤上的N和O等，这些位点可以与亲电试剂（如烷基化试剂、酰基化试剂等）反应而产生不可逆的变化，从而引起基因突变。以鸟嘌呤为例，结构见下图：

 

 

事实上，DNA的反应种类除了只反应某一处位点外，还会有一些比较复杂的反应类型：

 

有的碱基上不仅含有一个亲核位点，如果一个致癌物有两处亲电位点，反应一处后，还会和碱基的另外一个位点反应，生成一些小环。

 

双亲电基团的另外一个基团也有可能和两个不同的碱基链接，甚至可以和两个螺旋上的不同碱基链接。

 

另外，DNA的反应活性除了亲核性之外，主要还受空间结构的影响。

 

2、基毒杂质的来源

 

基因毒性杂质主要来源于原料药合成过程中的起始物料、中间体、试剂和反应副产物。此外，药物在合成、储存或者制剂过程中也可能会降解产生基因毒性杂质。 

 

3、基毒杂质的分类

 

参考ICH M7，它将基毒杂质根据不同的控制措施分为了以下五大类。

 

结合这个分类补充说明的两点就是：1）具有诱变性，不一定会致癌；2）具有警示结构，不一定具有诱变性。因此，通常1、2类是根据具体的实验数据来确认，而3、4、5类则根据科学的定量构效关系（Q）SAR或Ames细菌试验来确认。

 

4、基毒杂质的评估

 

目前基毒杂质的评估，主要采用两个互补的(Q)SAR 预测方法。一个方法基于专家知识规则，另一个方法基于统计学。

 

如果经两种互补的(Q)SAR方法预测均没有警示结构，则足以得出该杂质没有致突变性担忧的结论，可不做进一步的检测，归为第5类杂质。

 

基于专家知识规则的方法：规则来源于专家系统的知识和毒理学试验的结果，如DEREK。

 

基于统计学方法：由一组化合物的生物学和毒理学数据进行统计学分析预测，建立模型，再自动生成化学结构及所引发毒性作用的量化关系，预测待测物毒性。如Sarah Nexus。

 

5、基毒杂质的控制策略

 

基毒杂质的控制的基本策略是A-C-E（Avoid-Control-Expel），即避免基毒杂质生成、控制基毒产生和将基毒清除出产物。

 

 

1、通过改变原料、试剂及投料顺序可以避免生成基毒杂质；

 

2、通过反应机理的研究（如温度、时间、pH等）可以控制基毒杂质的生成；

 

3、通过后处理（如萃取、结晶、干燥等）可以去除已生成的基毒杂质。

 

在ICH M7中主要列举了以下四种控制策略：

 

原料药质量标准中控制在可接受限度以下，即终点控制。

 

起始物料或中间体标准或中控过程中控制在可接受限度以下，即原料或过程控制。

 

起始物料或中间体标准或中控过程中控制在可接受限度以上，明确杂质去向，结合加标试验的清除率，确保在成品中残留量小于可接受限度的30%以下。

 

充分理解工艺参数和影响杂质残留因素，能确保在成品原料药中的残留在可接受限度以下，无需检测，也不订入任何标准。如基于理化性质（反应活性，溶解性、挥发性等）的分析。

 

6、基毒杂质的控制方法

 

杂质控制的目的是为了保障患者的安全。同时杂质的毒性是与剂量息息相关的，基毒杂质也不例外。由于生物系统存在自我修复和纠正的功能，使得我们无法直接通过试验（如剂量从低到高，对其影响性进行线性推断）获得某个杂质的毒性阈值。

因此，对于基毒杂质的控制需要确定一个可接受其风险的摄入量------毒理学关注阈值（Threshold of Toxicological Concern，TTC）

 

TTC的定义是针对所有化学物质的一个暴露水平，当低于该水平时，无论是否获得化学特异性的毒性数据，在终生服用的情况下对人体健康都不会产生明显的危害。换句话说就是每天摄入1.5微克的基因毒性杂质，被认为对于大多数药品来说是可以接受的风险。因为它使得人一生的致癌风险小于十万分之一。而现实生活中，人一生得癌症的概率是四分之一。

对于TTC，我们需要说明的是：

 

1）TTC它是一个风险管理工具，采用的是概率的方法，不能被理解为是绝对无风险的保障。 

 

2）致癌性明确的杂质需进行特殊的风险评价，TTC 法并不适用。有几个结构基团被认定为具有非常高的基因毒性，它们即使被摄入低于TTC值的量也会面临非常高的基因毒性风险。如黄曲霉毒素类、N-亚硝胺类、烷基偶氮化合物类等。

 

3）结构不同的单个杂质的限度应该小于1.5微克/天。有相同作用机制、结构相似的杂质，其含量总和的限度仍应该参考1.5微克/天的限量进行评估（见表2）。而多个作用机制不同的基因毒性杂质可摄入总量则可应参考表3。

 

4）在某些特定情况下，TTC值高于1.5微克/天也是可以接受的。例如：

 

药物的短期接触，即治疗某些生命预期在5年以下的某些严重疾病。

 

它是一种已知物质，人类在其他方式上对它的摄入量会更高（如食品、环境中）。

 

它是一种体内代谢物，对它的评价也要以代谢物的可接受程度为基础。

 

7、基毒杂质的限度计算

 

第一种：具有阳性致癌数据的诱变杂质。如半数致癌剂量TD50，线性外推来计算可接受摄入量（AI，acceptable intake） 

 

计算公式：

 

第二种：基于TTC控制的杂质限度计算。TTC=1.5ug/day，短期暴露可适当提高。

 

计算公式：

 

第三种：有实际阈值证据的诱变性杂质。使用不确定因子，参考ICH Q3C计算允许日暴露量 （Permit Daily Expourse，PDE）。

 

计算公式：

其中，公式中各校正因子的规定如下：

 

F1是考虑物种间差异的因子

F1=5，适用于从大鼠外推到人

F1=12，适用于从小鼠外推到人

F1=2，适用于从犬外推到人

F1=2.5，适用于从家兔外推到人

F1=3，适用于从猴外推到人

F1=10，适用于从其他动物外推到人

 

F2=10，考虑个体差异的因子

所有有机溶剂一般取因子10。

 

F3是考虑短期暴露的毒性研究的可变因子

F3=1. 研究时间至少为动物寿命一半(啮齿动物或兔为1年，猫、狗和猴为7年）

F3=1. 涵盖整个器官形成期的生殖研究

F3=2，为期6个月的啮齿动物研究，或为期3.5年的非啮齿动物研究

F3=5. 为期3个月的啮齿动物研究，或为期2年的非啮齿动物研究

F3=10. 持续时间更短的研究

在所有情况下，对研究时间介于上述时间点之间的研究应用较大的因子，如对为期9个月的啮齿类动物毒性研究采用因子2。

 

F4是在诸如非遗传毒性致癌性、神经毒性或致畸性等严重毒性的情况下可应用的因子。

在生殖毒性研究中采用以下因子：

F4=1，与母体毒性有关的胎儿毒性

F4=5， 无母体毒性的胎儿毒性

F4=5， 有母体毒性的致畸反应

F4=10，无母体毒性的致畸反应

 

F5是未确定无反应水平时可应用的可变因子

在只有LOEL可用时，根据毒性的严重程度，可以使用高达10的因子。

 

体重调整假设任何成年人的体重为 50kg(不论性别）。

相对于这类计算中常用的60kg 或70kg 标准体重，较小的体重提供了额外的安全因子。有些成年患者体重小于50kg。在确定PDE时，对这些患者应考虑对固有的安全因子进行调整。

 

最后，补充一张ICH M7中公布的有特定阈值的杂质列表。