冷冻透射电镜

冷冻透射电镜（Cryo-Transmission Electron Microscopy，Cryo-TEM）技术一般是在普通透射电镜上加装样品冷冻装置，将样品冷却到液氮温度（77 K）来观测某些对温度敏感的样品（如蛋白、生物切片等）的一种技术。冷冻透射电镜的核心原理是利用冷冻技术将生物样品迅速固定在电镜载网上，保持样品在显微观察过程中的原始状态，由于冷冻过程中样品内部的水分瞬间凝固，使得样品中的生物大分子和细胞结构得到很好的保持。此外，冷冻过程中样品表面的脂质层也被冻结，避免了样品在观察过程中的干燥和变形，简言之就是通过对样品的冷冻，降低电子束对样品的损伤，减小样品的形变，从而得到更加真实的样品形貌。

冷冻透射电镜的优势：

①保持样品的原貌

传统的透射电镜在观察生物样品时，需要使用戊二醛等固定剂对样品进行处理。这种处理方法可能会导致样品中的生物大分子结构发生改变，从而影响到观察结果的准确性。而冷冻透射电镜则可以直接将样品固定在载网上，无需额外的固定处理，有效保持了样品的原貌。

②提高图像质量

冷冻透射电镜通过冷冻样品，使样品内部的结构保持在纳米级别的原始状态。这样，我们在观察样品时可以得到更高分辨率的图像，甚至能够观察到一些传统透射电镜无法分辨的细节。此外，冷冻透射电镜还可以通过调整电子束的强度和聚焦，进一步提高图像的质量。

③简化样品制备过程

传统的透射电镜样品制备过程复杂，需要经过固定、切片、染色等多个步骤。这些步骤不仅费时费力，而且容易引入人为误差。冷冻透射电镜则可以直接将样品固定在载网上，省去了繁琐的制备过程，降低了样品的制备难度。

④适用于各种生物样品

冷冻透射电镜可以用于观察各种生物样品，包括细胞、病毒、蛋白质等。无论是干燥样品还是湿润样品，冷冻透射电镜都能够轻松应对。这使得冷冻透射电镜在生物研究领域具有广泛的应用前景。

冷冻扫描电镜

冷冻扫描电镜(Cryo-scanning electron microscope，Cryo-SEM)基于扫描电镜的超低温冷冻制样及传输技术发展而来，无需对样品进行干燥处理，可直接观察液体、半液体样品，最大程度地减少了常规扫描电镜样品制备中的干燥过程对高度含水样品的不利影响，是国内外较为重视的一种电镜技术发展趋势。与同样可以观察含水样品的环境扫描电镜(environmental scanning electron microscope，ESEM)相比，冷冻扫描电镜具有能在高真空状态下观察含水样品、分辨率较高、可对样品进行断裂刻蚀等优点【附表：冷冻扫描电镜与常规扫描电镜和环境扫描电镜的比较（因本行研重点介绍冷冻电镜，所以对常规扫描电镜和环境扫描电镜只做简单比较）】。

表. 冷冻扫描电镜与常规扫描电镜和环境扫描电镜的比较

冷冻扫描电镜的关键是超低温冷冻制样及传输技术，常规扫描电镜上可以通过加载低温冷冻制备传输系统和冷冻样品台来改造升级为冷冻扫描电镜。超低温快速冷冻制样技术可使水在低温状态下呈玻璃态，以减少冰晶的产生，从而不影响样品本身结构；冷冻传输系统则保证在低温状态下将样品转移至电镜腔室并进行观察。其制样过程简单快速，无需对样品进行脱水、干燥，也无需使用锇酸等有毒试剂，只需利用超低温快速冷冻完成样品的固态化后，通过冷冻传输系统在低温状态下将样品转移至电镜样品舱中的冷台（温度可达185℃）上即可观察。此外，冷冻扫描电镜样品制备舱的冷冻台上配有冷刀（切断样品进行内部观察用）、加热器（升温除霜用）和喷镀装置，可简单快速地对预冷过的样品进行断裂、升华、镀金，暴露其内部结构以供观察。

冷冻扫描电镜的工作流程如下图所示：

①将样品用冷冻胶水固定于样品托上；

②将样品插入温度低于130K(-143．15℃)的过冷液氮雪泥中快速冷冻固定，在低于130K时，水分子的移动性非常慢以至于不能形成有害的冰晶；

③在真空条件下，将样品转移到安装在扫描电镜样品舱端口上的制样舱中的冷台上，根据需要进行冷冻断裂、冷冻升华刻蚀和溅射镀膜等处理；

④在真空条件下，将样品转移至扫描电镜样品舱中的冷台上进行超微结构观察。

图. 冷冻扫描电镜工作流程

3、冷冻蚀刻电镜

冷冻蚀刻（Freeze-etching）技术也叫冷冻断裂（Freezer-fracturing）或冷冻复型（Freeze-replica）技术，是生物材料电镜样品制备的常规方法之一。冷冻刻蚀技术的基本步骤是：首先将样品在冷冻剂中急速冷冻，然后在真空中切断，在切断后的断面上有细胞器，其间还有冻成冰的水分，稍加热使冰升华(水分挥发)，使细胞器的膜结构暴露出来，断面变得凹凸不平，好像“雕刻"一样，故称为冷冻刻蚀，如图所示。最后在真空中向断面喷镀铂一碳投影，再喷碳加固，这样，在断面形成一层复型膜，这层膜复印了细胞断面的立体结构。把复型膜下的组织腐蚀掉后，剩下的复型膜就是冷冻刻绌的电镜样品，它能很好地描述膜的主体结构。

图. 通过冷冻蚀刻技术得到的细胞表面

采用冷冻蚀刻技术制备的样品与通常的超薄切片样品相比较，其主要特点是：

①由于省去了超薄切片制样过程中强烈的化学固定、脱水、渗透、色埋以及染色的步票，因而避免了上述步骤中可能对细胞超微结构引人的一些人为假象，也就是说，采用冷冻蚀刻技术制备的样品有可能得到更近似于活体状态下的细胞图象；

②超薄切片给出细胞的平面图象，而冷冻蚀刻则得到浮雕似的细胞图象。因此，从冷冻蚀刻样品中可以更加形象地了解细胞与细胞之间，或同一细胞中各种细胞器之间的相互位置关系；同时，细胞若经特处理后再制成冷冻蚀刻样品，还能够请晰地看到由各种粗细不同的纤维构成的细胞骨架网结构；

③采用冷冻蚀刻技术可以直接看到细胞内生物膜（细胞质膜、核膜、线粒体膜和叶绿体片忌您）疏水区两个面上结构，诸如膜蛋白、核膜孔和细胞连接装置的形状、分布、密度等。

4、小结

冷冻透射电镜（Cryo-TEM）、冷冻扫描电镜（Cryo-SEM）和冷冻蚀刻电镜这三种技术都利用了冷冻技术来保持生物样品的自然状态，但它们在样品制备、成像原理和应用方面等方面各有侧重，如下表所示。每种技术的选择取决于研究目的和所需观察的样品特性。

资料来源：

[1] 资料来源：测试狗科研服务

[2] 张晓凯,张丛丛,刘忠民,刘力嘉,夏蕾.冷冻电镜技术的应用与发展[J].科学技术与工程,2019,19(24):9-17

[3] 肖媛,李婷婷,周芳,左艳霞.冷冻扫描电镜及其在生命科学研究中的应用[J].电子显微学报,2015,34(5):447-451

[4] 张景强．生物电子显微技术．中山大学出版社．1987

[5] 图片来源：百度百科

[6] 鲁崎唔.冷冻蚀刻技术及仪器[J].国外科学仪器,1990(4):38-4146