冷冻电镜使用流程

冷冻电子显微学解析生物大分子及细胞结构的核心是透射电子显微镜成像，其基本过程包括样品制备、冷冻、透射电子显微镜成像、图像处理及结构解析等几个基本步骤，如下图所示。

图. 冷冻电子显微学解析结构基本步骤

1、样品制备

冷冻电镜的样品制备是整个流程中非常关键的一步。首先，需要选择适合冷冻电镜观察的样品，如蛋白质、细胞或病毒等。然后，将样品制备成纯净的溶液或悬浮液。接下来，将样品滴在特制的网格上，并通过吸附或冷冻的方式将样品固定在网格上。

2、冷冻

冷冻是冷冻电镜中非常重要的一步，它能够保持样品的原始结构。冷冻的主要目的是使样品迅速冷却到液氮温度，避免样品在冷冻过程中发生结构变化。通常，可以使用液氮冷冻样品，或者将样品暴露在液氮中的乙烷中进行冷冻。

3、电子显微镜扫描

在冷冻样品制备完成后，需要将样品放入电子显微镜中进行扫描。在电子显微镜中，样品受到电子束的照射，并通过透射电子显微镜模式观察样品的结构。通过调整电子束的条件和样品的位置，可以获取不同角度和不同焦距下的图像。

4、图像处理

获得的电子显微镜图像通常是模糊且包含噪声的。因此，需要对图像进行处理，以获得更清晰、更准确的结构信息。图像处理的主要步骤包括去噪、增强对比度、对齐和三维重建等。通过这些处理步骤，可以获得高分辨率的三维结构模型。

5、结果分析

需要对获得的结构模型进行分析和解释。可以使用分子建模软件将蛋白质或其他生物分子的原子坐标与结构模型进行比较，以验证模型的准确性。此外，还可以使用其他生物物理学和生物化学技术对结构进行进一步的验证和研究。

冷冻电镜优势及技术难点

1、冷冻电镜的优势

（1）样品需求量少

与其他结构生物学研究方法相比，冷冻电子显微学对样品的需求量非常少。以单颗粒重构技术为例: 对于生化性质及构象均一性很好的样品，只要几万至十几万个分子的图像，即有可能获得近原子分辨率的三维结构；对于具有高度对称性的病毒等大分子复合物，甚至只要几千个颗粒的图像即可达到原子分辨率1。实际操作中，一个冷冻样品只需要 3~5 µL 0.1~1 µmol的蛋白质溶液。这与X射线晶体学和核磁共振波谱学对样品量的大量需求形成了鲜明的对比。

（2）更接近生理状态

冷冻电子显微学通过将样品快速冷却（冷却速度可达每秒10万度）至玻璃态冰达到固定生物含水样品的目的，其观察的结构信息基本上反映样品冷却前 的瞬时状态。因为冷冻电镜的样品制备不需要结晶，而是直接对生物样品的溶液状态或细胞内状态进行冷冻制样分析，因此是更接近样品生理状态的一种结构生物学研究手段。

（3）适用研究对象广泛

冷冻电子显微学可以观察的样品尺度范围相当广泛。从细胞、细胞器到分子量在 500 kD 以上的大分子复合体，均是冷冻电子显微学的传统研究对象。最近几年来，随着冷冻电子显微镜的硬件技术尤其是图像采集设备的迅速发展，冷冻电子显微学已经可以对 200 kD 以上的蛋白质结构进行高分辨率解析并在继续突破更小的分子量下限。

（4）可以对不均一样品进行研究

与其他结构生物学手段相比，冷冻电子显微学的一个独特优势是直接获取放大几万倍至十几万倍的样品微观图像，并通过对多个分子图像的统计学分析获得结构信息。这种统计分析的过程可以将样品中可能存在的多种分子结构分类，从而将组成不同、构象不同的分子区分开来。目前在实践中使用的多种针对分子结构进行二维和三维分类的算法已经相对比较成熟，从而使得对均一性较差样品的高分辨率结构解析变得可能2。更重要的是，对大量单分子结构的分类使我们除了获得这些不同类别的分子结构外，还获得了这些不同分子结构在样品中的统 计分布。对不同温度、不同溶液和不同生化反应时间点的这种结构异质性的统计分析，将使我们获得与结构信息相关联的生物大分子复合体热力学及动力学的重要信息，从而更深入地揭示其分子机制3。

2、冷冻电镜的技术难点及未来发展的趋势4

与其他的结构生物学和生物物理学研究方法类似，冷冻电子显微学在硬件设备上的长足进展解决了很多关键性的技术难点，使该方法的应用普及成为趋势。同时，一些其他的技术难点凸显出来，成为结构解析中的瓶颈。

（1）样品制备技术

样品制备一直是冷冻电子显微学研究的关键步骤。对于生物大分子结构研究来说，需要保证单颗粒分子以合适的密度均匀分布于厚度合适的无序冰中，才有可能获得良好的电子显微数据进行结构解析。由于不同的生物大分子与样品支持膜的相互作用及在水溶液中的性质各不相同，分子在样品中的分布状态各异。目前普遍采用的冷冻制样技术在基本原理上仍然采用 30 年前发明的方法，实验可重复性、操作可移植性、通用性等都很差。样品制备已经成为冷冻电子显微学结构解析的限速步骤。冷冻电子显微学要想成为结构生物学研究的主要应用手段，必须在样品制备这一步骤取得重要的突破。类似的，对于细胞结构研究来说，将本身很厚的细胞样品进行减薄处理，才适合冷冻电镜观察。

（2）高分辨率结构的分析与建模

应用冷冻电子显微学技术在过去的两年里所获得的近原子分辨率(4 Å 以上)三维结构的数目几乎超过了前面几十年所获得的高分辨率结构数目之和。更多的在 4~8 Å 分辨率范围内的结构在很短时间内被解析出来。不同的分辨率结构可以揭示出的结构细节亦不同。而与晶体学手段不同，冷冻电子显微学单颗粒重构无法通过对晶格衍射点的信号强弱来判断分辨率，因此如何客观地对三维重构的结果进行检验、明确结构解析的分辨率是目前高分辨率冷冻电镜研究中的一个重要问题。在此基础上，需要对不同分辨率水平的三维重构进行原子模型的构建，从而实现在原子水平上对分子功能的解释。对于分辨率在 4 Å 以上的三维重构基本可以应用 X 射线晶体学现有的方法进行建模；对分辨率在 4 Å 以下的三维结构如何建立较为可信的模型，则仍缺少相对成熟并被普遍接受的方法。

（3）生物大分子构象不均一性的分析

冷冻电子显微学单颗粒结构解析技术与晶体学技术的一个重要差异是不需要溶液中的生物大分子形成高度有序的晶体排列，因而可以直接获得溶液中的生物大分子结构。但生物大分子尤其是大分子复合体本身的构象柔性亦因此没有被固定在晶体结构中，这些构象柔性反映在电子显微图像中，常常是导致三维重构无法获得高分辨率结构的根源，将不同构象的分子分开分析是提高重构分辨率的重要过程。此外，分子在溶液中的不同构象很可能反映了分子发挥功能的不同结构形态，理解这些构象差异对于解释分子功能的机制非常重要。目前对生物大分子构象不均一性的分析是冷冻电子显微学结构解析中的技术难点和热点。

（4）电子光学新技术方法在生物样品研究中的应用

材料科学超高分辨率研究在过去十几年里也发生了很多重要的技术进步，主要是电子显微镜光学系统的不断完善和提高，以及新的成像手段的进步。新的技术诸如球差矫正、色差矫正、扫描透射电子显微镜系统等都在材料科学领域结构分辨率的显著提高中发挥了重要作用。目前，利用最新的电子光学成像系统，物理学和材料科学研究者已经可以获得0.5Å的分辨率。随着对生物样品近原子分辨率结构解析能力的逐渐普及，更高的分辨率必然成为冷冻电子显微学发展的下一个目标。如何应用材料科学领域证明对超高分辨成像卓有成效的电子显微学方法来提高生物样品的结构解析分辨率，是摆在所有冷冻电子显微学家面前的新机遇和挑战。

资料来源：

[1] Zhang X, Ge P, Yu X, et al. Cryo-EM structure of the mature dengue virus at 3.5-Å resolution. Nat Struct Mol Biol, 2013, 20: 105–110

[2]Fernandez I S, Bai X C, Hussain T, et al. Molecular architecture of a eukaryotic translational initiation complex. Science, 2013, 342: 1240585

[3]Liu J J, Bratkowski M A, Liu X, et al. Visualization of distinct substrate-recruitment pathways in the yeast exosome by EM. Nat Struct Mol Biol, 2014, 21: 95–102

[4]王宏伟.冷冻电子显微学在结构生物学研究中的现状与展望[J].中国科学：生命科学, 2014, 44(10):9.DOI:10.1360/052014-140.