摘 要： 建立反相高效液相色谱法同时测定降脂通便胶囊中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5种蒽醌含量。样品用甲醇回流提取后用硫酸水解，用三氯甲烷萃取，以Sepax Bio-C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱分离，以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液（体积比为23∶42∶35）为流动相，流量为1 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为35 ℃。5种蒽醌的质量分别在0.058 8～0.352 8、0.703 6～4.221 6、0.067 2～0.403 2、0.083 6～0.501、0.105 8～0.634 8 μg范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系，相关系数均不小于0.999 8，方法检出限为0.001 5～0.004 2 μg/mL，定量限为0.004 7～0.013 3 μg/mL。样品加标平均回收率为96.47%～98.35%，测定结果的相对标准偏差为1.1%～2.0%（n=6）。该方法满足降脂通便胶囊中5种蒽醌成分的测定要求，可以为降脂通便胶囊的质量控制提供一定的技术参考。

关键词： 高效液相色谱法； 降脂通便胶囊； 蒽醌

 

降脂通便胶囊是由酒大黄、人参、玄明粉、灵芝等6味中药材组成的中成药制剂，其功能为泻热通便、健脾益气，用于治疗肠胃实热、脾气亏虚所致的大便秘结、腹胀纳呆、形体肥胖、气短肢倦等症，或由高血脂导致的上述症状。根据君臣佐使配伍，其中的君药为酒大黄，酒大黄为大黄的炮制品，大黄的功效为泻下攻积、逐瘀痛经、清热泻火、凉血解毒、利湿退黄，用于实热积滞便秘、血热吐衄、目赤咽肿、拥肿疗疮、肠拥腹痛、瘀血经闭、产后淤阻、跌打损伤、湿热痢疾、黄疽尿赤、淋证、水肿等疾病的治疗，外治烧烫伤；酒大黄更善于清上焦的血分热毒，亦可用于目赤咽肿、齿龈肿痛[1]。酒大黄中蒽醌主要功效为泻下、活血化瘀、抗菌止血功效等，其中具有泻下功效的成分主要是蒽醌类成分，如大黄酸等。降脂通便胶囊目前执行的标准[国家食品药品监督管理总局国家药品标准WS-6013 (B-0013)-2014Z]和文献[2‒6]只测定君药酒大黄中含有的大黄酚和大黄素的总量，并没有测定酒大黄中其他蒽醌，如大黄酸、芦荟大黄素和大黄素甲醚的含量。《中华人民共和国药典》2020年版一部大黄，测定了上述5种成分的总量。目前还没有同时测定上述5种蒽醌的文献报道。根据中医整体观理论，中药是一个多成分复杂体系，其中部分成分并不能全部代表其功效和质量，越多的成分表征越能更加全面地对其质量进行控制。笔者参照相关文献[7‒10]，采用反相高效液相色谱法同时测定降脂通便胶囊中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5种蒽醌成分的含量，为降脂通便胶囊的质量控制提供一定的参考。

 

1. 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：U3000型，配二极管阵列检测器，美国赛默飞世尔科技公司。

分析天平：XS205DualRang型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多集团。

超声波清洗器：SK5200HP型，昆山市超声仪器有限公司。

水浴锅：HH-16型，上海甘易仪器有限公司。

芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品：纯度(质量分数)分别为98.3%、99.3%、98.7%、99.2%、99.3%，批号分别为110758-201817、110757-201607、110756-201512、110796-201621、110757-201607，中国食品药品检定研究院。

甲醇、乙腈：均为色谱纯，德国默克公司。

磷酸、硫酸、无水硫酸钠：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

0.1%磷酸溶液：吸取1 mL磷酸，置于1 000 mL容量瓶中，加水至标线，摇匀。

实验用水为超纯水。

降脂通便胶囊样品：市售。

1.2 色谱条件

色谱柱：Sepax Bio-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，苏州塞分科技股份有限公司)；柱温：35 ℃；进样体积：10 μL；检测器：二极管阵列检测器(DAD)；检测波长：254 nm；流动相：甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液(体积比为23∶42∶35)；流量：1 mL/min。

1.3 溶液配制

分别精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，混合均匀，加入甲醇配制成芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的质量浓度分别为29.4、351.8、33.6、41.8、52.9 μg/mL的混合对照品溶液。

1.4 样品处理

取降脂通便胶囊(批号为20181105)内容物，混匀，取约0.2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，称定质量，置于80 ℃水浴中回流提取30 min，冷却至室温，再次称定质量，用甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5.0 mL，置于圆底烧瓶中，于80 ℃水浴中挥去甲醇，加入2.5 mol/L硫酸溶液10 mL，超声处理5 min，使其溶散，再加入三氯甲烷10 mL，于80 ℃水浴中加热回流60 min，冷却至室温，将溶液转移至分液漏斗中，用三氯甲烷洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，剩余溶液用三氯甲烷重复提取2次，每次8 mL，合并三氯甲烷液，用无水硫酸钠脱水，将三氯甲烷液移至玻璃蒸发皿中，挥去三氯甲烷，加入甲醇使残渣完全溶解，将溶液转移至10 mL容容量瓶中，加入甲醇定容至标线，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得样品溶液。

按照降脂通便胶囊制备工艺，制备缺酒大黄药材的样品，按样品溶液制备方法制备阴性样品溶液。

1.5 定性、定量方法

在1.2色谱条件下，分别测定混合对照品溶液和样品溶液，根据5种蒽醌的保留时间进行定性，以标准曲线法进行定量。

 

2. 结果与讨论

 

2.1 目标成分选择

根据中医理论的整体性和中药成分的复杂性，选取降脂通便胶囊制剂中的君药酒大黄作为研究对象。选取酒大黄中大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚5种蒽醌类成分作为测定的目标成分，与国家食品药品监督管理总局国家药品标准WS-6013(B-0013)-2014Z相比，增加了芦荟大黄素、大黄酸和大黄素甲醚3种成分，能够更好地体现制剂的质量。

2.2 提取方法选择

酒大黄中蒽醌类成分的提取方法有超声提取和回流提取[11‒14]，水解溶剂有盐酸溶液和硫酸溶液[15‒17]，萃取溶剂有乙醚和三氯甲烷[18‒22]。

分别考察了超声提取和回流提取两种提取方法。结果显示，回流提取后芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5种蒽醌总含量较超声提取高，故选择回流提取。

分别考察了盐酸和硫酸两种水解溶剂。结果显示，硫酸水解用时较短，而且芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5种蒽醌总含量相对盐酸水解较高，故选择硫酸为水解溶剂。

分别考察了乙醚和三氯甲烷两种萃取溶剂。结果显示，三氯甲烷萃取后芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5种蒽醌总含量比乙醚萃取高，而且三氯甲烷层位于下层，较容易分离，故选择三氯甲烷为萃取溶剂。

2.3 色谱条件选择

采用二极管阵列检测器在200～400 nm波长范围内对混合对照品溶液进行扫描，在波长254 nm处各组分均有较大紫外吸收，且色谱峰的峰形较好，故检测波长选择254 nm。

分别考察乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液3种不同流动相体系时目标物的分离效果。结果表明，以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液(体积比为23∶42∶35)为流动相时，各组分出峰时间适中，分离度符合要求，故选择流动相为甲醇-乙腈-0.1%磷酸(体积比为23∶42∶35)。

考察色谱柱柱温分别为20、25、30、35、40 ℃时的色谱峰形和分离度。结果表明，在上述温度下，各组分色谱峰没有显著差别，为保证色谱条件一致，设置柱温为35 ℃。

2.4 专属性试验

精密吸取混合对照品溶液、样品溶液和阴性样品溶液各10 μL，按1.2色谱条件进样分析，色谱图如图1所示。由图1可以看出，5种蒽醌均能够很好地分离，分离度均大于1.5，理论塔板数均大于10 000，阴性样品溶液在相同保留时间处没有干扰峰，该方法专属性符合要求。

 

图1   混合对照品溶液、样品溶液和阴性样品溶液色谱图

Fig. 1   Chromatograms of mixed reference solution，sample solution，and blank sample solution

 

2.5 线性方程与检出限

在1.2色谱条件下，用自动进样器依次吸取混合对照品溶液2、4、6、8、10、12 μL注入高效液相色谱仪进行测定，以对照品的质量为横坐标(x)，以对应的色谱峰面积为纵坐标(y)，分别绘制5种蒽醌的标准工作曲线，计算线性方程和相关系数。取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品溶液，用甲醇逐级稀释，在1.2色谱条件下进行测定，以3倍信噪比对应的溶液中目标物的质量浓度为方法检出限，以10倍信噪比对应的溶液中目标物的质量浓度为定量限。5种蒽醌质量线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限见表1。

表1   质量线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

Tab. 1   Linear ranges of mass，linear equations，correlation coefficients，detection limits，and quantification limits

 

2.6 精密度试验

称取批号为20181105的样品6份，按1.4方法平行制备6份样品溶液，在1.2色谱条件下分别测定5种成分的色谱峰面积，代入标准工作曲线方程计算5种成分的含量，结果见表2。由表2可知，测定结果的相对标准偏差为1.1%～2.0%，表明该方法精密度良好。

表2   精密度试验结果

Tab. 2   Results of precision test

 

2.7 加标回收试验

精密称取0.1 g样品，精密加入适量的5种蒽醌对照品，按样品溶液制备方法平行制备6份加标样品溶液，在1.2色谱条件下分别进样测定，结果见表3。

表3   样品加标回收试验结果

Tab. 3   Results of sample spiked recoveries test

 

由表3可知，样品加标平均回收率为96.47%～98.35%，表明该方法准确度满足分析要求。

2.8 稳定性试验

精密吸取同一样品溶液10 μL，分别在第0、2、4、8、12、24 h进样分析，测得5种成分含量，结果见表4。由表4可知，测定结果的相对标准偏差为0.5%～1.0%。表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

表4   稳定性试验结果

Tab. 4   Results of stbility test

 

3. 结语

 

建立了高效液相色谱法同时测定降脂通便胶囊中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5种蒽醌成分含量。对目标成分选择、提取方法及色谱条件进行了优化。该方法满足降脂通便胶囊中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5种蒽醌成分的测定要求，可以为降脂通便胶囊的质量控制提供一定的技术参考。

 

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