鱼肝油中的维生素D3的测定方法

本文对样品提取溶剂和提取方法进行优化实验，简化样品前处理步骤，此方法具有简便易行、精密度高、回收率高的特点。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

高效液相色谱仪（日本岛津，LC-20AT 泵，SPD- 20 AV 检测器）；LC Solution 色谱工作站 （日本岛津）；恒温 SHA-CA 水浴振荡器、电子分析天平：金坛市国旺实验仪器厂；WSL-2A 比较测色仪：上海现科仪器有限公司；SZC-C 脂肪测定仪：上海纤检仪器有限公司。

1.2 材料与试剂

丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正己烷（均为分析纯）；正己烷、异丙醇（均为色谱纯）；VD3 标准品：Sigma；鱼肝油为抽检样品。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Rx-SIL（5 μm，4.6 mm× 250 mm）；流动相：正己烷：异丙醇（体积分数比）95∶5；流速：1.0 mL/min；检测波长：264 nm；柱温：40 ℃；进样量：100 μL。

1.3.2 标准溶液的制备

准确称取 10.00 mg 的 VD3 标准品于小烧杯中，用正己烷溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中，摇匀，得到浓度为 100 μg/mL 的标准储备液。

1.3.3 样品溶液的制备

准确称取 5.00 g 样品于 100 mL 的容量瓶中，先用适量正己烷使其溶解，再用正己烷定容至刻度，剧烈振荡 2 min，静置分层，取上层有机相过 0.45 μm 的有机滤膜备用，以供液相分析。

2 分析与结果

2.1 检测波长的确定

参照文献可知，运用紫外扫描仪进行图谱扫描，得出此条件下的最大吸收波长为 264 nm。

2.2 流动相的确定

对以下几种正己烷∶异丙醇（体积分数比）80∶20、 85∶15、90∶10、95∶5 进行单因素试验，综合考虑色谱峰、保留时间、分离效果得出最佳流动相比例为正己烷∶异丙醇体积分数比（体积分数比）95∶5。

2.3 柱温的确定

柱温升高的同时，极性和非极性溶质的容量因子会随着减小，从而会缩短保留时间。柱温并不是越高越好，在整个的升温过程中可得到塔板高的一个最小值，此时的柱效达到最高[10]。结合仪器本身其它部件的耐受程度，最终确定最佳柱温为 40 ℃。

2.4 流速的确定 因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于厂家来说，每一根特 定的色谱柱，都对应有一个最佳流速。本实验的最佳流速为1.0 mL/min。

2.5 样品溶剂的确定

本实验研究的是从鱼肝油中提取 VD3 ，因为 VD3 是脂溶性的，易溶于有机溶剂，因此尝试直接用有机溶剂溶解样品，稀释上机。又考虑到样品本身对色谱柱的影响，要求每次进样的样品浓度低于 10 g/100 mL。

在溶剂的选择上，分别用丙酮、石油醚、正己烷、乙 酸乙酯溶解油样，定容，过 0.45 μm 的有机滤膜上机。

测量的结果显示乙酸乙酯误差最大，丙酮、正己烷、石 油醚无明显差异。同时考虑到溶剂本身对色谱柱的影响，综合分析得出正己烷作为溶剂最合适，测量结果准 确，对柱子的损坏最小。

2.6 标准品及样品的色谱图

根据检测波长、流动相、流速、柱温等色谱条件讨论，参考标准GB 5413.9-2010《婴幼儿食品和乳品中维 生素  A、D、E》的测定中给出VD的进样量，得出最佳色谱条件为检测波长 264 nm、流动相为正己烷∶异丙醇（体积分数比）95∶5、柱温40℃、流速为1.0 mL/min、进样量 100 μL。

取抽检的鱼肝油按照 1.3.3 的要求制备样品溶液， 同时按 1.3.2 的标准储备液进行稀释，选择的上述最佳色谱条件对样品溶液及标准溶液进行色谱分析，以保 留时间定性和外标法定量，得出的标准品及样品的色谱图如图1 和图 2。

2.7 标准曲线及检出限的确定

准确吸取VD3的标准储备液0.20、0.80、2.00、5.00、20.00 mL 于 100mL 棕色容量瓶中，用分析纯正己烷溶解定容至刻度混匀。得到浓度分别为0.20、0.80、2.00、 5.00、20.00 μg/mL 的标准品溶液。按照本方法的最佳色谱条件进行测定。以峰面积为横坐标，以 VD3的标准品浓度为纵坐标绘制标准曲线。同时以3倍仪器响应值标准偏差与标准曲线斜率的比值来计算仪器的检测限，10 倍噪音比来确定定量限。实验结果表明本方

法的灵敏度较高，能满足实际测定的要求。其结果见表 1。

2.8 精密度和回收率的测定

采用本方法对抽检的已知VD3含量的鱼肝油中加入高、中、低 3 个浓度的标准液，每个浓度重复测量4 次求平均值进行精密度和回收率测定，其结果见表2。

由表 2 可知，采用本方法测得的数据结果表明其回收率和精密度都达到了很高的要求。平均回收率为94.2 %，RSD 为 0.62 %，结果可靠。

2.9 不同来源的鱼肝油中 VD3的含量测定

以抽检的几批不同厂家的鱼肝油为研究对象，运用本实验的最佳色谱条件进行测定，外标法定量，其结果见表3。

由表 3 的测量结果显示，抽检的不同厂家的鱼肝油中 VD3的含量存在明显的差异，甚至同一厂家的不同批次的鱼肝油中 VD3含量也有明显差异，这可能跟原料的处理、加工工艺等因素有关。

3 结论

本文建立了一种新的快速测定鱼肝油中VD3含量的分析方法。通过对色谱柱、检测波长、流动相、流速等多个影响因素进行详细分析最终得出最佳的色谱条件。该方法中 VD3浓度在 0.2 μg/mL～20 μg/mL 范围内，峰面积与含量具有良好的线性关系（r=0.999 7），平均相对标准偏差为 0.62 %，平均回收率为 94.2 %。同时对样品的前处理进行了很大的改进，经过多次实验的准确验证，得出此方法具有简便易行、分离效果好、精密度高、回收率高的特点。