脂溶性维生素A、D、E (VA、VD、VE) 是人体维持正常代谢和机能所必需的营养素。强化食品和特殊医疗用途等配方食品是补充维生素的重要途经。准确测定食品中维生素含量对于科学膳食，并保证食品安全具有重要意义。
GB5009.82-2016是现行的关于食品中VA、VD、VE测定的标准方法，其适用范围涵盖婴幼儿食品、乳品、肉与肉制品、食用植物油、坚果、豆类和辣椒粉等多种食物基质。关于食品中维生素D测定的新标准方法GB5009.296-2023现已发布，将于2024年3月6日正式实施，新标准主要增加了固相萃取的样品制备方法和在线二维柱切换的反相液相色谱法，本文按照标准的第二法，采用固相萃取法的样品净化方式，结合在线二维液相色谱方法，同时对婴幼儿配方乳粉中VA、VD和VE进行了分析。
一、实验步骤
1、溶液配制
1.1 抗坏血酸水溶液（0.2 g/mL）：4 g抗坏血酸，加20 mL的水溶解；
1.2 BHT-乙醇溶液（0.2 g/100 mL）：称取1 g BHT，加500 mL的乙醇溶解，临用前配制；
1.3 50%（m/m）氢氧化钾溶液：称取50 g氢氧化钾，溶于50 mL水中，冷却后置聚乙烯瓶中；
1.4 5%甲醇水溶液：将5 mL甲醇和95 mL水混合均匀。
1.5 乙腈-甲醇混合溶液（3+1）：将30 mL乙腈和10 mL甲醇混合均匀。
2、样品制备
注：处理过程应避免紫外光照。
2.1 均质样品
称取粉末试样25 g（精确至0.01 g）至250 mL干燥玻璃瓶中，加入约200 g温水（约40 °C～45 °C），记录加水后的溶液质量（精确至0.01 g）。充分混匀溶解，室温避光放置15 min，每隔5 min振摇30 s。
2.2 皂化
称取均质后试样5 g（精确至0.01 g）至50 mL带螺旋盖的离心管中，加入2 mL抗坏血酸水溶液（0.2 g/mL），6 mL BHT-乙醇溶液（0.2 g/100 mL），涡旋混匀30 s，再加入3 mL氢氧化钾溶液，涡旋混匀后于80 ˚C±2 ˚C条件下避光涡旋振荡30 min，立即冷却，待提取净化。
2.3 提取净化
（1）活化：SelectCore vADE维生素专用柱200mg/6mL，依次使用6 mL甲醇、6 mL水活化；
（2）上样：皂化液在8000 r/min下离心5 min。全部上清液转移至固相萃取柱中，过柱速度控制在每分钟不超过60滴；
（3）淋洗：用10 mL 5%甲醇水溶液洗涤离心管，涡旋30 s，在8000 r/min下离心5 min，将上清液一并转移到固相萃取柱上样，重复操作2次，弃去淋洗液，真空抽至柱体近干；
（4）洗脱：用8 mL乙腈-甲醇混合溶液（3+1）分三次洗脱，负压抽干，收集洗脱液加水定容至10 mL，溶液用0.45 μm Nylon针式过滤器过滤，取滤液作为待测液；
3、在线二维液相色谱法测定
3.1 在线二维液相色谱系统
仪器系统: Agilent 1260 Infinity II二维系统;
系统配置:
1260 Infinity II四元泵 (G7111B) ;
1260 Infinity II二元泵 (G7112B) ;
1260 Infinity II自动进样器 (G7129A) ;
1260 Infinity II柱温箱 (G7116A，内置两位六通阀) ;
1260 Infinity II VWD (G7114B×2) ;
1290 Infinity阀驱动 (独立的阀驱动装置，G1170A，配1个两位六阀头，在双阀单检测器的二维系统中使用) ;
仪器软件: Agilent OpenLab CDS 2.6
在线二维柱切换液相色谱系统见图1所示
图1.在线二维液相色谱系统（A.单阀双检测器；B.双阀单检测器）
3.2 实验条件
色谱柱：
第一维色谱柱: vADE-1D-A, 5μm, 4.6×150mm
第二维色谱柱: vADE-2D-A, 3μm, 2.1×100mm
捕集柱: vADE-Trap-A, 5μm, 4.6×10mm
捕集柱卡套: 分体式保护柱卡套
流动相和梯度程序:
表1梯度洗脱程序
流速:
第一维泵: 1.0 mL/min;
第二维泵: 0.4 mL/min;
阀切换程序( 图1A和图1B左阀 ) :
0.0~12.1 min, 1-6;
12.1~12.7 min, 1-2;
12.7~25.0 min, 1-6;
阀切换程序( 图1B右阀 ) :
0-16.5 min, 1-6;
16.5-24.5 min, 1-2;
24.5-25.0 min, 1-6;
波长切换程序:
第一维: 0~9 min, 325 nm;
9~25 min, 294 nm;
第二维: 0~25 min, 264 nm;
进样量: 100 μL
柱温: 35 ℃
二、实验结果与讨论
1、二维捕集柱考察：
为考察二维接口上捕集柱的效果，本实验按照确定的方法进浓度为5 μg/mL的VD2和VD3混合标准品溶液，在确认第一维目标峰的峰起点处开始切换阀至1-2位，结果由图2可见，目标峰从开始切割的起点至从捕集柱中流穿起点近2 min，说明捕集柱对目标待测物的捕集效果较好，且捕集时间窗能够完全满足方法测试要求。
图2.目标待测物VD的第一维色谱分离谱图（A）以及切割至捕获柱后的分离谱图（B）
实验 谱图
按照确定的色谱条件，进VADE混合标准品溶液、样品溶液和加标样品溶液，结果见图3和图4，其中VD2和VD3的分离度＞2.0，完全满足方法测试要求。
图3.采用单阀双检测器的二维系统时维生素ADE混合标准品溶液(a)与样品溶液(b)在第一维（A）与第二维（B）分离的对比谱图（1, VA; 2, δ-VE; 3, β+γ-VE; 4, α-VE; 5, VD2; 6, VD3）
图4.采用双阀单检测器的二维系统时维生素ADE混合标准品溶液(a)、加标样品溶液(b)及样品溶液(c)的叠加谱图，其中0~16.5 min为第一维；16.5~24.5 min为第二维（1, VA; 2, α-TE; 3, δ-VE; 4, β+γ-VE; 5, α-VE; 6, VD2; 7, VD3）
2、线性关系及定量限考察
取维生素ADE的混合标准品溶液(VA浓度为1 μg/mL, 4种VE的浓度均为5 μg/mL, VD2和VD3浓度均为0.05 μg/mL)分别进样5、10、20、50和100 μL，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，考察各待测分析物的线性相关关系。由表2结果可以看出，所有目标待测物分析物的线性相关关系较好（相关系数r2＞0.9999），其中定量限(LOQ)按S/N=10:1计算，VD2和VD3的LOQ分别为0.00116 μg/mL和0.00086 μg/mL；当固体取样量为0.5 g，定容5 mL，进样体积为100 μL时，VD2和VD3的方法定量限（MQL）为1.16和0.86 μg/100 g。
表2 线性相关关系及定量限考察
3、重复性考察
取同一样品溶液，按照确定的色谱条件连续进样5次，计算目标峰保留时间和峰面积的RSD。结果所有目标峰保留时间的RSD＜0.1%；VA峰面积RSD为1.56%；α-VE峰面积的RSD为0.12%；第二维中VD3峰面积的RSD为2.24%，表明本法重复性较好。
4、加标回收率数据
表3 样品加标回收率测定结果
三、实验结论
本实验针对新发布的标准方法(GB5009.296-2023)食品中维生素D测定第二法进行了重现，采用固相萃取的样品提取净化方法，结果婴幼儿配方奶粉基质样品中目标物分离无干扰，初步的方法学考察结果也表明本法准确可靠；且可同时完成维生素A和α-维生素E（α-VE）的定量。与传统的液-液萃取方法比较，固相萃取法操作更简便，无需繁复的多次萃取、水洗、脱水、旋蒸和氮吹、定容等步骤，同时也无需正相色谱的净化步骤，可提升样品分析通量，整个分析过程和结果更加可控，纳谱分析推出的SelectCore vADE维生素专用柱是一种新型的单分散聚合物填料的固相萃取柱，相比市场上常见的聚合物产品，滴速更快，回收率更稳定。另本法允许大体积进样，以满足VD含量较低的样品基质的分析要求。
