2021年，PDA发布了技术报告60-3：工艺验证、生命周期的方法，附件2生物制药原液的生产，其中提高层析介质的相关验证是工艺验证的重要一部分。层析介质需要证明其在生命周期内保持一致性的能力，需要评估层析介质的清洁程序的有效性以及清洁程序对层析介质寿命的影响，更重要的是，该报告还提出层析介质需要验证能够保持其性能所需要的保存时间和保存条件的验证，而这是行业大多数企业常忽略的一点。

为了更好地满足监管机构的期望以及行业企业更好地进行层析介质相关验证的实践，本文提出了一种层析介质寿命、清洁和保存验证的综合设计，该设计综合利用了缩小模型和商业化规模运行，前瞻性工艺验证与持续工艺验证，并且完全符合法规对层析介质验证的期望。

层析介质的寿命、清洁和保存验证的综合设计主要包括以下步骤：

● 步骤1：层析介质清洁程序的开发

● 步骤2：层析介质缩小模型的寿命和清洁验证

● 步骤3：层析介质商业化规模的清洁确认

● 步骤4：层析介质寿命和清洁的持续确认

● 步骤5：层析介质的保存验证

步骤1

层析介质清洁程序的开发

 层析介质的清洁程序本应是层析纯化工艺固有的一部分。特定的层析纯化必须要包含特定的层析介质清洁程序。

清洁程序的开发需要考虑层析过程中的污染物、清洁试剂的选择以及清洁工艺参数的研究。清洁工艺参数应像开发层析分离工艺参数一样进行研究，必要时可采用FMEA风险评估和缩小模型进行DoE实验设计，以便确定清洁工艺参数之间的交互作用和设计空间。

最后，清洁程序需要放大，应在大规模的生产工艺中建立最终的清洁工艺操作和性能参数的操作范围，并且要符合GMP的要求。

图1. 亲和层析填料Mabselect SuRe的清洁程序的设计空间示意图。

步骤2

层析介质缩小模型的寿命和清洁验证

该步骤是在缩小模型同时进行层析介质的寿命和清洁验证，目的一是验证层析介质的可重复使用次数，二是同时验证清洁程序对寿命的影响以及清洁程序对残留物累积效应的控制。

该验证的操作方法是首先建立层析步骤的缩小模型，同时对缩小模型进行确认，以保证能够代表大规模的层析操作；然后设计层析介质的寿命验证，在寿命验证的同时，适时进行模拟运行，验证清洁程序的有效性。

案例：

本案例设计层析介质缩小模型的寿命验证，共进行121个循环，每隔10个循环的收集样品进行全部检测指标的检测。

同时在寿命验证期间周期性的进行了模拟运行，模拟运行是每隔10个循环进行一次。模拟运行的洗脱收集液检测HCP和HCD，以及使用银染SDS-PAGE检测总蛋白杂质的残留。

表1：层析介质寿命验证部分结果数据

表2：模拟运行结果数据

步骤3

层析介质商业化规模的清洁确认

尽管在缩小规模上综合设计了层析介质的寿命和清洁验证，但是还是需要在商业化规模的层析柱上来验证层析介质的使用寿命和清洁有效性。这可以伴随着工艺性能确认（PPQ）批次进行。

PDA技术报告49，生物技术产品的清洁验证考虑要点，提到了商业化规模下进行清洁验证的方法，其中适用于层析介质商业化规模清洁验证的方法包括淋洗水法和模拟运行方法。

案例：

该案例是一个CHO-K1细胞培养表达单克隆抗体的生产工艺，商业化规模为2000L。该案例的层析介质清洁验证是伴随三批次的工艺性能确认（PPQ）进行，采用模拟运行的方法。

 表3

基于几批次的原液生产，平均原液产量为2925g，即可计算该清洁工艺验证的残留物为：

● 总蛋白残留（BCA）：< 2.330mg/g

● 总HCP残留：< 1.154ug/g

● 总DNA残留：< 3.402ng/g

此外，SDS-PAGE银染没有检测到任何蛋白带，微生物限度和内毒素也符合原液的批次放行结果。

最终，证明该清洁工艺在商业化生产规模上也具有很好的效果。

步骤4

层析介质寿命和清洁的持续确认

在产品获批进入商业化生产之后，仍需要一个持续工艺确认的方案来确认在商业化生产规模上，层析介质可一致的处于验证过的受控状态，比如使用寿命、残留物累积、病毒清除等。

对于层析介质使用寿命，应持续监控在预估的使用寿命期间的层析步骤收率、工艺相关杂质和产品相关杂质的去除，以及该步骤相关的其他检测指标，以确认层析介质和纯化工艺性能处于受控状态。

对于层析介质的清洁状态，可通过持续的监控清洁工艺参数，比如清洁剂浓度、接触时间、清洁温度等确认清洁工艺处于受控状态。也可进行商业化规模的模拟运行，比如每10个生产批次来持续确认清洁工艺的有效性。

另外，还应建立变更控制程序来维持层析介质受控的验证状态。

步骤5

层析介质的保存验证

尽管层析介质供应商可以提供相应层析介质在其保存试剂条件下的长期稳定性数据和加速稳定性数据，但是供应商提供的数据不能代替层析介质保存条件验证，因为供应商的稳定性数据使用的是新填料，并且常规是散装条件下的保存验证。

真正的生产过程中，层析介质的保存有可能是拆装后的散装保存，也可能是直接在装柱条件下的保存，另外，生产过程中的层析介质保存时基本都是经历过生产使用过程。因此，进行层析介质的保存验证需要考虑这些实际生产过程情况。

因此，无论进行散装条件还是装柱条件下的保存验证，最好采用使用过的层析介质，建议使用次数＞10次。

保存验证中选择合适的保存容器、保存溶液和保存时限，在保存初始检测层析介质的微生物限度、内毒素以及相应的功能性检测，包括但不限于粒径分布、压力流速、动态结合载量等。保存到一定时限时，重复上述检测，更换保存缓冲液，直至重复更换三次。

保存验证的结果可支持本公司使用相同层析介质的多个产品项目。

总结

上述提出的层析介质寿命、清洁和保存验证的综合设计符合监管期望，并且符合行业的常规操作。综合利用了缩小模型与商业化规模，前瞻性验证与持续工艺验证的理念，是行业关于层析介质相关验证的良好实践。

同时，为了保证最终商业化生产的顺利进行，选择合适的供应商，并要求提供相应的法规支持文件和更多的通用适用数据，是选择层析介质并能成功应用的前提，这也是层析介质相关验证中不得不考虑的一点。