强制降解试验的目的

强制降解目的识别可能的降解产物，建立降解途径，明确分子的化学稳定性，并验证分析方法的专属性。

小编  了解降解途径，能把降解杂质结构研究出来最好。

强制降解试验的开展时间

文献中重点提及新药研究，FDA建议在Phase III阶段进行降解试验。对于API，应进行不同pH溶液、氧气和光照、高温高湿条件下的降解试验。采用一批样品进行，结果在年报中进行提交。

小编 对于仿制药研发，一般在工艺优化完成后、分析方法验证过程中，由分析人员开展。为了有更多的时间研究强制降解杂质，在工艺研发期间，合成人员就应该提前介入强制降解的研究，酸破坏、碱破坏、氧化破坏等。分析验证期间，分析人员更多的是执行一些有实验基础数据的实验。也许有些企业是这么做的。

降解的程度

降解多少才合适这个问题，一直有争议，一般认为降解5%-20%，对于分析方法含量验证是可以接受的。

有些科学家认为10%的降解程度是最佳的。其他科学家建议可在API中加入已知降解杂质，去考察监控药品稳定性的方法。

没必要要求强制降解试验一定要产生降解产物。如果在加速稳定性方案中的降解条件下，原料药和药品没有降解，那么降解研究可以终止。

过度降解可能导致二级降解产物，失去降解研究的意义。而这在产品的储存期间可能并不会产生。推荐在溶液中进行最长为14d的降解试验（氧化降解试验最长24h），为分析方法开发提供降解样品。

降解条件设计方案

对于原料药和药品，通常的降解方案如下流程图所示：

降解条件最少应包括酸碱水解、热、氧化、光照，还可能有冻融循环等。指导原则中没有pH、温度、氧化剂的特别规定。光降解试验根据ICHQ1B中要求的光源进行。最初目标是找到使原料药产生大约10%降解的条件。

降解试验中最常用的降解条件见表1。

科学家发现，开始时使用80℃条件或更高温度条件，可以通过短时间（2，5，8，24h等）内，多个时间点取样测试评估降解速率。主要降解杂质和次级降解杂质会通过早期时间点的检测进行区分，有助于更好的理解降解途径。

还有一种方法是按表1中的条件开始降解，然后根据情况增加或减弱条件来获得足够的降解。这种降解策略较好，理由如下：

使用剧烈条件时降解路径可能发生改变；

当使用高浓度反应试剂，如酸、碱等，在进行HPLC 分析时，样品需要中和或稀释。

样品浓度的选择

降解试验中采用何种浓度？

目前指导原则中没有规定。文献研究者推荐采用1mg/ml作为起始研究浓度，通常可以获得很小的降解杂质。有些降解研究建议在最终处方浓度下进行。

降解条件分析

水解降解

水解降解一般在较宽pH范围内进行，包括化合物与水的反应。

酸碱降解包括原料药与酸或碱接触后产生主要降解杂质。

酸或碱的种类和浓度的选择取决于药物的稳定性。一般选择盐酸或硫酸(0.1-1M)为酸水解和氢氧化钠或氢氧化钾(0.1-1M)作为碱水解的条件。

如果化合物难溶于水，可加入其他助溶剂使其在盐酸或氢氧化钠溶液中溶解。助溶剂的选择应基于药物的结构。

降解试验一般从室温开始，如果没有降解，则提高温度为50-70℃。降解不应超过7天。降解样品用适当的酸、碱或缓冲液中和，以避免进一步发生降解。

氧化降解

过氧化氢广泛用于原料药的氧化降解研究。其他氧化剂，例如：氧气和自由基引发剂（AIBN，偶氮二异丁腈）也可以使用。氧化剂的种类、浓度、氧化条件的选择取决于药物本身。

文献报道样品采用0.1-3%过氧化氢溶液在中性pH条件、室温下放置7天或者达到20%的降解时，可能会生产相关的降解杂质。胺、硫化物和苯酚易受电子转移氧化产生N -氧化物、羟胺、砜和亚砜。不稳定氢如苄基碳、烯丙基碳、和叔碳或α-位氢原子容易氧化形成氢过氧化物、羟基或酮。

光降解

药物的光降解试验应证明对光不会发生变化。光降解试验应将药物置于UV或荧光条件下产生主要降解杂质。推荐条件见ICH指导原则。

原料或固体/液体制剂应采用1.2 million lx h和200Wh/m2的光进行研究。通常采用300-800nm波长进行光降解。最大光照强度为6 million lx h。

光降解可通过自由基机制诱导产生光氧化。

热降解

热降解(例如：干热和湿热)应该在比ICH Q1A规定的加速条件更剧烈的情况下进行。

固态的原料药和药品样品应该在干热和湿热的条件下进行研究；而液体制剂应在干热条件下进行研究。

研究应该在较高温度较短时间下进行，一般选择40℃-80℃条件下进行。

稳定性指示方法

稳定性指示方法（SIM）是用来对制剂中API的降解进行定量测定的方法。

在FDA指导原则中，SIM是一个定量分析方法，可以用来检测药物和制剂随时间变化的稳定性情况。SIM在检测API时，不应受到降解产物、杂质和辅料的干扰。降解试验是用来研究SIM方法的专属性的。开发一个SIM可以用于处方前研究、稳定性研究、贮藏条件开发。

以下是采用HPLC开发满足法规要求的SIM方法的步骤。

样品

开发SIM方法时，原料药的降解条件应比加速试验剧烈，包括水解、氧化、光照、热条件。API进行固体和液体条件下的降解是为了真实贮藏条件下可能产生的降解杂质。

方法开发与优化

在方法开发前，应了解药物的理化性质，如pKa、logP、溶解度等，为HPLC方法的开发奠定基础。logP和溶解度有助于选择流动相和溶剂，而pKa有助于确定流动相的pH值。

降解样品组分的分离首选反相色谱柱，不同比例的甲醇、水、乙腈可以作为初始条件进行分离研究。选择甲醇还是乙腈，应基于分析物的溶解度。开始时水-有机相比例可以为50：50，适当的调节获得好的分离度。为获得更好的分离度与峰对称性可加入缓冲液。

色谱柱温度的变化可影响方法的选择，30-40℃的柱温适合产生好的分离重现性。药物色谱峰在色谱图中保留时间最好晚一点，使所有的降解产物能被分离，同时药物峰出现后，也应运行足够长的时间，保证药物色谱峰后的降解杂质能够充分洗脱出来。

分析方法开发过程，有时药物色谱峰中包着一个杂质峰或降解杂质峰，与药物一起洗脱下来。这时需要用峰纯度的检测来确定方法的专属性。

直接方法包括改变色谱条件中的流动相比例、色谱柱等，来改善分离。调整色谱条件后再进行光谱比较。

如果降解产物在加速试验和长期试验中不产生是可以接受的。方法可以通过调节流速、进样体积、色谱柱类型、流动相比例进行邻近色谱峰的优化。

方法验证

根据USP/ICH指导原则进行线性、准确度、精密度、专属性、定量限、检测限、耐用性和耐受性的验证。应该能够分离、识别、定量鉴定限（通常为0.1%）以上的杂质。如果方法验证不符合要求，应进行调整和重新验证。

文献中还提到了其他分析方法，感兴趣的可以查阅源文献。

参考文献

Journal of Pharmaceutical Analysis 2014;4(3):159–165