本文提出了一种新型的VHP灭菌工艺，满足在较低温度状态下，借助循环风机完成过氧化氢汽化。高浓度过氧化氢易制爆，“低温”则大大提升了灭菌工艺的安全性。借助大风量的风机，可使过氧化氢气体的粒径更小、穿透性更强。在生物安全领域，关于袋进袋出系统的灭菌一直备受关注（以下简称“BIBO”系统），新型VHP灭菌工艺可实现对“BIBO”系统的灭菌挑战，并通过了CMA认证。
1、引 言
近年来疫情频发，传染病日趋国际化，生物安全已然纳入国家安全范畴。为应对日趋严峻的疫情，中国计划到2025年建立5到7所四级生物安全实验室，目前国内通过CNAS验收的四级生物安全实验室（P4 实验室）有两个，分别是2018年1月验收的中科院武汉病毒研究所和2018 年7 月验收的中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。一个P4 实验室一般会配套几个P3 实验室以及多个P2 实验室，如此庞大的生物安全防护体系，在维护管理方面有着严格的要求。
生物安全实验室能达到生物安全的要求，主要通过防护屏障和管理措施两种方式。在一个试验周期完成后，需要对整个实验环境进行灭菌，生物安全实验室防护区域内的消毒灭菌是规避实验室感染风险的有效措施。高等级生物安全实验室装有特殊的空调系统，进入的空气温度、湿度与洁净度都需要进行调节，进出空气都要经过过滤效率为99.99%的HEPA过滤器，并保证实验室内空气的换气次数达到国家标准要求[1-2]。实验室采用定向负压系统，实验室内的空气只能通过排风系统排出，而不会向外围空间泄漏，高等级的生物安全实验室排气系统要求经过双级高效过滤器，以保护实验室外的空气不受污染。
复杂的空调系统设计以及较高的病菌污染风险，向高效过滤器的灭菌发起了更高级的挑战。最典型的是箱式“BIBO”系统HEPA过滤器单元，一般安装于实验室顶部的设备层或实验室旁的设备间，用于高级别的生物安全实验室（四级或有特殊要求的三级生物安全实验室）。采用气体灭菌剂在箱体内循环往复穿透HEPA过滤器，动力源为气体发生器，气流经过过滤器后有明显压降，双级高效过滤器对过氧化氢气体拦截明显。因此穿透高效要求发生器的风量大且发生的气体粒径小，对过滤器进行原位消毒灭菌，操作安全、简便。截至目前，过氧化氢干雾技术、微冷凝技术以及传统的加热闪蒸技术，均无法实现对“BIBO”系统的灭菌。
图1 加热闪蒸式工艺原理图
2、VHP灭菌工艺
2.1VHP灭菌工艺的概述
最早在1980s 年，美国STERIS公司发现过氧化氢汽化后，会比液态过氧化氢有更强的杀芽孢能力。随后1990 年汽化过氧化氢正式通过美国EPA 核准，作为灭菌剂，并很快在各个工业领域运用。
汽化过氧化氢（以下简称“VHP”）属于一种广谱抗菌剂，可杀灭包括病毒、细菌、细菌孢子、真菌，甚至线虫卵、外毒素和朊病毒等[3-4]。在灭菌结束后会，过氧化氢气体降解为水和氧气，不会生成对人体、环境有害的物质，灭菌时间短，纯气态工艺，材料兼容性好[5]。VHP®即Vaporized Hydrogen Peroxide，在业内已被广泛接受和认可，随着VHP灭菌工艺的发展，相类似的灭菌工艺技术如雨后春笋般发展起来，但在灭菌效果和灭菌过程控制方面却大相径庭。
2.2传统VHP灭菌工艺
传统的VHP 灭菌工艺一般采用加热闪蒸法，过氧化氢液体在蠕动泵作用下，被滴在加热温度长期保持在120~130℃的不锈钢板上，过氧化氢液体瞬间快速蒸发为气态过氧化氢，气体随着空气流送入灭菌空间[6-7]。质量分数高于8%的过氧化氢均属于易制爆危化品，在高温下，如果过程控制不好，将会造成严重安全事故。此外，该工艺对过氧化氢的纯度也有着较高要求，如果过氧化氢杂质残留在加热板上，日积月累，加热板上会附着一层厚厚的杂质层，如果不及时清理，将会影响加热板的导热，不但影响汽化效果，还存在一定的隐患。
2.3新型VHP灭菌工艺
新型VHP 灭菌工艺采用低温喷射法，可消除加热闪蒸法带来的安全隐患，同时还增添了过程控制方面的新元素。喷嘴位置分上下两部分，下端进气，上端进液。在喷射管下端，通过风量较大的循环风机引入空气流935 m3/h，在喷射管上端，通过蠕动泵导入过氧化氢，瞬间空气将过氧化氢液体打散喷出，喷嘴形状呈蘑菇形，蘑菇形的顶盖将喷出的过氧化氢气体阻截，并扩散到腔室中，腔室的加热带将刚喷出的过氧化氢气体恢复至室温，从而稳定扩散至灭菌空间。该工艺采用低温灭菌，安全性能大幅提升。灭菌剂选用常规的过氧化氢，管壁或腔体上无任何残留，便于设备的维护和管理，灭菌工艺也更加稳定[8-10]。
图2 常温喷射式工艺原理图
新型VHP 灭菌工艺可通过无线通讯功能，实现远程控制。Real VNC 是一个远端控制软件，Router 是灭菌设备的无线路由器，在灭菌区域外借助手机、平板、电脑等通讯工具，即可对灭菌设备进行控制并实时监控灭菌数据。Victory是过氧化氢发生器，为过氧化氢气体发生的源头，设备本身具有温度、湿度、过氧化氢浓度探头。TS1000 是可选配的远端探头，用于监测过氧化氢气体最难达到位置的温度、湿度、过氧化氢浓度，适用于较复杂的房间。AR1200 是可选配的过氧化氢降解器，设备由铂系金属组成，催化降解过氧化氢，降解速率高达2039 m3/h，一般也可以借助洁净室空调系统来降解过氧化氢。新型VHP 灭菌工艺在过程控制和灭菌效果方面的优势是独一无二的，由B&R（贝加莱）控制系统来调节过氧化氢注射率，通过设定饱和度的上限和下限，当饱和度达到上限，则停止注射过氧化氢，当饱和度低于下限时，则设备重新开始注射过氧化氢。
图3 常温喷射式设备连接示意图
3、材质兼容性测试
凡是VHP 在灭菌过程中可接触的设备及材料表面，均应考虑其对VHP 强氧化性的耐受性，中国军事医学科学院选用新型的VHP 灭菌工艺，对生物安全实验室用到的各种材质进行了材质兼容性测试。图四为过氧化氢浓度变化趋势图，VHP浓度设置在1.5-2mg/L(＞900 ppm)，持续灭菌超过5 小时。通过灭菌前后对比分析，得出新型VHP灭菌工艺对进行测试的部件有良好的材质兼容性。
图4 过氧化氢浓度趋势图
4、“BIBO”系统解决方案
4.1实验仪器及耗材
4.2测试步骤
（1）使用PAO发烟设备对高效过滤器检漏，确认高效过滤器完整、密封性好。
（2）按下图方式连接过氧化氢发生器与BIBO系统，并在BIBO过滤系统内部布置指示剂。采样点编号说明：01 和02 送风箱体上沿两角、03 和04 初效后挡板上沿两角、05初效后挡板中间位置、06 和07 一级高效后箱体上沿两角、08 和09 一级高效后挡板上沿两角、10一级高效后挡板中间位置、11 和12 二级高效后箱体上沿两角、13 和14 排风箱体下沿两角、15 二级高效后挡板外侧。
图5 指示剂布点图
图6 BIBO 系统与设备连接示意图
（3）设定过氧化氢发生器注射率级风机风量，连续三次使用同一设定参数对同一组BIBO 系统灭菌，灭菌完成后取出生物指示剂放入含有中和剂的培养基中在56℃恒温培养箱培养7d，同时设一组阳性对照组和一组阴性对照组，分别观察三次灭菌后的生物指示剂培养结果，得出灭菌结论。
5、“BIBO”系统灭菌结果
5.1灭菌数据
BIBO 双级高效过滤器全长5000mm、高750mm、宽620mm，体积约为2.3m3，有挡板的高效过滤器滤芯尺寸610mm * 610mm * 292mm，两个高效过滤器滤芯间距1500mm，较小的灭菌体积，结合复杂的灭菌结构，气体的循环往复使得腔室内温度有所提升，平均升高12.6℃。密闭箱体内加入大概300mL 的35%过氧化氢，使得湿度有所提高，第一次增加10.6%，第二次增加1.5%。温度升高会使湿度降低，所以第三次由于起始温度较低、湿度较高，在过氧化氢注入的过程中理论上湿度是应该增加的，但由于温度也在升高，升温造成湿度更大程度的降低，所以造成第三次灭菌后湿度反而减少5%。
5.2指示剂结果
5.3CMA认证
经过三次VHP 灭菌，每次灭菌结果均合格，新型VHP灭菌工艺顺利完成了高等级生物安全实验室“BIBO”系统的灭菌挑战，并通过具备相关资质的第三方检测机构（北京环安生物技术服务有限公司）检测，获得CMA 认证。
图7 CMA 认证资质
6、结论与展望
新型VHP 灭菌工艺是对传统加热闪蒸技术的升级，在较低温度状态下完成灭菌，确保灭菌全过程的安全性。该工艺对过氧化氢纯度要求较低，适用性强，灭菌过程中腔体内不会有试剂残留，便于设备的维护和管理。过氧化氢气体在循环风机作用下以较小的粒径，较大的风速扩散至灭菌空间，穿透性强，可以穿透HEPA 过滤器，因此可为生物安全柜、局部RABS 系统、隔离器等含有HEPA 高效的设备、系统进行灭菌。本文首次报道了新型VHP 灭菌工艺对高等级生物安全实验室“BIBO”系统的灭菌挑战，三次平行试验杀灭对数值均不小于6，顺利通过了第三方验收，并获得CMA 认证。
生物安全实验室是一座坚不可摧的“堡垒”，高效过滤器则是“堡垒”与外界相通的“窗户”，当然也是病原微生物的集中地带，如何把好生物安全领域最后的“关口”，将拦截住的病菌进行有效杀灭，防止病菌蔓延传播，一直是生物安全行业的焦点。新型VHP 灭菌工艺在生物安全、制药等领域所带来的技术革新，实现了对病原微生物的有效控制，为生物安全实验室的发展保驾护航。
参考文献
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本文作者魏延传，吉林医药设计院有限公司，来源于化学工程与装备，仅供交流学习。
