一、实验原理

流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种单细胞定量分析技术，该技术通过测定库尔特电阻、荧光、光散射和光吸收等参数，可以定量分析细胞的结构特征（如DNA含量、蛋白、细胞膜、胞浆或胞核抗原表达量）和功能特征（如细胞内酶活性、钙流变化等）等多种重要参数，进行细胞特征分析与分选。它的核心功能是将混合物中的不同细胞分离并计数，将感兴趣的细胞分选出来，提供分类比例并进行进一步分析。

二、实验步骤

（一）样本制备

1.取样: 取100μL抗凝血。

2.标记：根据抗体说明书标记实验管。混匀后，室温避光孵育15分钟。

3. 溶血：将10×裂红液用水稀释10倍，每管加入1mL，振荡器混匀后室温避光静置10分钟，300g，4°C离心5分钟。

4. 洗涤：弃去上清，加入1mL 1×PBS洗液，300g离心洗涤5分钟，洗2-3次。

5. 上机检测：弃去上清后加入500μL 1×PBS，混匀悬浮后过滤，避光等待上机检测。

（二）仪器操作

1. 打开流式细胞仪、开启液流、质控。

2. 分选前设置：共包含两个步骤，第一，调节合适的液流断点，待四路窗口形成清晰的5路液流，其中含4个收集液流，一个废液流后，利用“sweetspot”锁住此断点；然后利用Accudrop 珠子，调整 “Drop Delay”时间，当左侧液流接近 100%，而且保持相对稳定的范围的时间是最佳时间。

3. 设置分析条件：完成质控后，建立用户文件夹、当日实验文件夹，根据细胞标记，选择所需参数，根据各抗原之间生物关系及实验主要关注点，画好 FSC-SSC及各荧光参数两两相对的散点图，根据抗原生物关系设置分析门，及群级联关系表。

4. 确定电压：先上对照管，根据淋巴细胞在 FSC-SSC散点图中的位置，调整 FSC和SSC两个参数的电压，保证淋巴、单核及中心粒细胞呈现在合适的位置，然后设置P1 门圈住淋巴细胞；根据阴性细胞群位置，调整好其它荧光参数的电压，记录10000个细胞。

5. 分类计数：上阳性管，通过分级设门，完成各抗原之间生物关系的呈现，及各细胞分类计数情况。

6. 分选设置：在“sort layout”窗口，设置收集装置和纯度模式，然后设置分选门，圈住CD4或CD8 阳性的细胞，将分选门分别填入左右“sort location field” 框中。

7. 分选：将收集管中分别装200ul 1XPBS，放入仪器分选仓下面的收集管架上：点“sort”开始分选，此时“sort location field”框中可见所获得的CD4或CD8阳性的细胞数目；收集到足够的目的细胞后，停止分选。

8.细胞纯度检测：利用上样针清洗液和水清洗上样针，直到以水上样时，FSC-SSC散点图中“无点”为止。将分选获得的CD4阳性细胞上样回测，观察细胞分选纯度；再次清洗上样针，将分选获得CD8阳性细胞上样回测，观察细胞分选纯度。

三、实验结果

通过上述步骤，我们可以成功分选并收集到特定的T细胞群体。

分类结果分析：外周血CD8+T细胞在T淋巴细胞中占比：46.7%，外周血CD4+T细胞在T淋巴细胞中占比：36.3%。

分选细胞纯度分析：外周血CD8+T细胞在T淋巴细胞中占比：98.3%，不含外周血CD4+T细胞，表明分选成功。