活性氧（ROS）是氧代谢的天然副产物，正常情况下，机体含量较低。当机体受到损伤刺激时，如药物毒性、缺氧等，ROS水平会急剧增加，超过机体自身清除能力时，机体氧化-抗氧化作用失去平衡，从而导致细胞膜破坏，最终引起机体细胞死亡。因此，ROS的测定有助于判断细胞损伤情况。

 

基本原理：目前检测细胞内ROS水平常用的是DCFH-DA荧光探针法。DCFH-DA可以自由穿过细胞膜，本身没有荧光。细胞内的酯酶可将DCFH-DA水解生成不能通过细胞膜的DCFH，这样使得探针在细胞内形成积聚。经过经细胞内ROS的氧化，DCFH可转变为有荧光的DCF，且荧光的强度与ROS的水平成正比。

 

一、实验流程

 

以下是流式细胞仪检测贴壁细胞ROS的实验步骤及注意事项。

 

实验步骤：

 

1、准备细胞：将目的细胞均匀铺至六孔板中，实验组和对照组分别做相应处理，并预设空白管（即不装载探针）。至细胞密度达到80%-95%。

 

2、清洗：用PBS将六孔板中细胞分别清洗1-2次，并弃去PBS。

 

3、消化：用胰酶将六孔板中细胞消下来，移至1.5mlEP管中，并做好标记。

 

4、离心：1200r，常温，离心5min。

 

5、探针配制：按照2μl DCFH-DA原液：3ml无血清培养基配制，上下颠倒混匀（注意避光）。

 

6、加入探针：弃去4中培养基，空白管加入1ml无血清培养基，其余均加入1ml配制好的探针液，并重悬细胞（注意避光）。

 

7、孵育：37°C避光孵育20min。

 

8、离心：1200r，常温，离心5min，弃去上清。

 

9、清洗：用1ml冷PBS清洗，1200r，常温，离心5min，弃去上清，重复2次（注意避光）。

 

10、上机：将细胞用500μl冷PBS重悬，并移至流式管，上机。

 

注意事项：

 

1、消化细胞时，以细胞刚好掉落为好，不可时间过长，避免过度消化造成细胞损伤而影响实验结果。

 

2、探针配置时，一般按照1：1000用无血清培养基稀释DCFH-DA（终浓度为10Μm），不同的细胞系条件有所不同，需自行摸索。

 

3、加入探针后，一定要充分混悬细胞，以保证探针完全结合。

 

4、探针孵育时，每隔3-5min需颠倒混匀。

 

5、探针孵育时间不同细胞可能会不一样，一般为20-30min。

 

6、最佳激发波长为488nm，最佳发射波长为525nm。

 

二、结果分析

 

FlowJo 是一款流式细胞数据分析软件，通过图像分析细胞的各种变化，利用自带的分析功能，导出可以二次编辑的图形。它可以支持多种格式，并且可以做出质量不错的图。接下来介绍如何对活性氧（ROS）的流式-单染数据分析。

 

1、导入流式数据（以fcs格式为例）：

 

将要导入的文件（一个或多个）拖入All Samples中。

 

图 1

 

2、设置横纵坐标：

 

根据以下箭头所示位置，将横轴设置为FSC-A：：FSC-A，纵轴设为SSC-A：：SSC-A。

 

图 2

 

3、调整细胞群：

 

分别调整以下箭头所示位置，将绝大部分目的细胞调整至视野中。

 

图 3

 

选择Customize Axis，将细胞群调整至中间位置，点击Apply，横纵轴操作一样。

 

图 4

 

4、圈出主要细胞群：

 

点击下图所示位置，点击设门工具，选取目标细胞。

 

图 5

 

圈出大多数细胞至90%以上。弹出对话框输入细胞名称，点击OK。

 

图 6 

 

5、调整横纵坐标：

 

双击圈出的细胞群，就可以直观看到所圈出的细胞群。 

 

图 7

 

参考步骤2将横轴改为FL4-A：：APC-A，纵轴更换为Histogram，即X轴选择荧光通道，Y轴选择直方图。 

 

图 8

 

6、将门应用到所有细胞：拖动图8所示的门至上方的All Samples中，即可看到这个门应用到了所有细胞，（如果需要单独应用，则拖到相应的细胞即可。）双击任意一个门，即可看到刚才的直方图。点击上方的左右箭头可以查看其他的样本。

 

图 9

 

7、绘制图形

 

点击上方的Layout Editor，出现右侧涂层框。

 

图 10

 

将一个门拖入涂层窗口中，这样会自动做一张信息图。

 

图 11

 

将其他的样本依次拖入这个直方图中（如果拖动到页面中就再单独添加一张图），就得到一张叠加图。 

 

图 12

 

点击鼠标右键，在Histograms中可以选择直方图的叠加方式，比较常见的为Offset。

 

图 13

 

双击流式图，在Specity窗口中点击Smoothing对曲线进行平滑，会好看很多。

 

图 14

 

通常我们不需要右侧的表格，选中按下Delete进行删除，至此就得到了一张基本可以发表的流式图。

 

图 15

 

8、导出编辑：

 

在Layout的File菜单中，点击Export Image。如果使用AI，选择SVG格式；如果使用CorelDraw，使用EMF格式。

 

图 16

 

参考资料：

 

https://images.app.goo.gl/SAR9CiAzR4xBoCZr8

 

Arfin S, Jha NK, Jha SK, et al. Oxidative Stress in Cancer Cell Metabolism. Antioxidants (Basel). 2021;10(5):642. Published 2021 Apr 22.

 

Rajneesh, Pathak J, Chatterjee A, et al. Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cyanobacteria Using the Oxidant-sensing Probe 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate (DCFH-DA). Bio Protoc. 2017;7(17):e2545. Published 2017 Sep 5.