我们的色谱柱可以有金刚不坏之身而永久服役吗？我们都知道这是不可能的，但是倒有方法可以预防色谱柱使用寿命过短。

我们会不会觉得实验室的经费好像都在用来买色谱柱了？我们是否会想为什么色谱厂家不能生产寿命更长的色谱柱呢？实际上，如果在使用过程中有适当的保护，购买色谱柱的费用只占色谱分析总费用中非常小的部分。一般色谱柱正常使用的寿命大概500-1000针左右，如果以这个数字来计算，色谱柱所占有的费用大概是整个分析费用的1-2%而已。所以就算是我们觉得色谱柱的单价很高，想努力增加额外的保护以增加其寿命，其实对整体分析而言也无法省下太多费用。我的观点是，如果一支色谱柱能有500针的进样，就可以算是完成它的使命了。在一般情况下，对色谱柱寿命的合理期望是什么样的呢？又有哪些保护措施可以延长色谱柱使用寿命？

什么是对色谱柱的寿命的合理期望呢？

首先看看另外一位色谱学家Ron Majors的发现。在他发表的文章中，他对色谱柱的寿命做了一些调研。图1是他在文章中对2011年调研得到的数据，我们可以看到有将近3/4的受调研者可以得到至少500针的进样次数（24% + 47% = 71%），而将近一半的可以得到至少1000针的进样次数（47%）。这是很令人惊讶的结果，因为这个调研包括了各种不同类型的色谱柱，而不只是针对一般比较常用和耐用的150 mm × 4.6 mm规格、粒径为5 μm的反相色谱柱。                                             

图1 2011年每支色谱柱寿命结束前的进样量调研结果

再来看看由1997 到2011年之间又有何变化（图2），这图表有几点值得一提：

（1）   进样量少于1000针（绿色）的比例由1997年的76%逐年降到2011年的53%；

（2）   进样量超过1000针（紫色）的比例则逐年上升；

（3）   进样量500针以内（棕色）的比例由1997的50%左右减少到2011年的25%左右；

（4）   进样量100针以下（蓝色）的不良结果在那么多年来大概就保持10%左右。

图2  1997-2011年色谱柱寿命结束前进样量的比较

对这些结果我做了以下大胆的推测：首先我不认为色谱柱寿命增加主要是因为色谱厂家生产技术进步，因为在1997年以后（本文调研开始），装填色谱柱的技术已经算是很成熟了。所以我认为寿命增长的主要原因是实验室人员在色谱柱的使用上得到了更好的教育和训练，也就是说实验室人员了解如何前处理样品和知道如何保护色谱柱。而我怀疑那些进样量少于100针的主要原因是不恰当的操作，而不是色谱柱的问题。这篇文章将针对如何保护色谱柱提出一些建议。

绝对不要进样“垃圾”

我经常开玩笑说，要保护色谱柱以得到最长寿命的方法就是不要开封色谱柱。一旦开始使用，色谱柱的寿命就逐渐衰减一直到用坏为止。而影响色谱柱寿命的两个主要因素是样品中的杂质和颗粒，因此如果我们能够在进样前去除样品中的杂质和颗粒，色谱柱的寿命一定会延长。前处理的方法包括固相萃取（SPE），液液萃取和其他的过滤方法。简单地说，如果在样品进入色谱柱前能大量减少其中的污染物，色谱柱的寿命一定会延长，但是同时我们也必须考虑花在前处理的时间和费用是否能得到合理的回报。如果目前使用的色谱柱已经达到500针的进样量，而使用前处理所增加的时间和费用，如果需要将色谱柱的寿命由进样500针增加到2500针才划得来的话，就必须好好考虑是否前处理有其经济效益。但是如果进血浆样品，不经过前处理，可能不到10针柱子就废了，这时候前处理就非常有必要了。但是除了经济效益以外，对于使不使用前处理，对色谱数据的优劣也必须做一个比较。在我们实验室中，这些前处理往往能够让我们即使在更低的浓度下也能收集到有效的数据，也能让我们得到更一致的结果。

不管有没有使用前处理，建议所有的样品在进样前经过过滤或是离心处理。例如当样品经过滤膜可以滤除颗粒从而减少堵塞色谱柱的筛板，滤膜的孔隙大小必须小于色谱柱的筛板孔径大小。一般大于3 μm颗粒的色谱柱使用2 μm大小的筛板，3 μm颗粒的色谱柱则使用0.5 μm的筛板，而小于3 μm颗粒的色谱柱一般使用0.2 μm的筛板，因此最通用的0.45 μm的滤膜基本可以用在除了亚2 μm颗粒以外所有的色谱柱；对于亚2 μm颗粒的色谱柱，一般使用0.2 μm大小孔隙的滤膜。大多滤膜是事先封装好，可以直接接在注射器进行过滤或是作为96孔板的过滤板。

虽然使用滤膜是有效果，但是建议首先考量以下四点：

（1）滤膜并不便宜，虽然每一片的单价并不是很贵，但是加起来的费用就不便宜了；

（2）过滤会花费额外的时间，使用0.5 μm滤膜过滤很慢，而使用0.2 μm滤膜就更慢了；

（3）严格地讲，一旦过滤一个样品，对其他样品，不管有没有必要过滤，都得过滤，以免出现不必要的变量干扰实验数据；

（4）一旦使用过滤，对方法开发进行验证时，也必须验证过滤程序。由于过滤过程往往会损失样品，因此我们需要确定是否存在不同成分损失程度不一致的情况，特别在高浓度和低浓度的时候。

由于使用滤膜是费时费钱的工作，因此每个实验室要先做评估是否值得。但是不可否认，使用滤膜过滤样品在绝大多数的情形下是可以增长色谱柱的寿命。

另外可以取代或是补充滤膜过滤的方法就是进样前使用离心处理样品。这是简单又经济的方法。离心后，一些容易堵塞筛板的大颗粒会沉淀在离心管底部，然后可以很简单取样进行分析。多年来我们一直使用这种方法在蛋白样品的分析，几乎没有发生过因为颗粒堵塞色谱柱的问题。我曾经有过在使用UHPLC时，虽然样品经过0.2 μm的滤膜过滤但是还是有些浑浊，进这种样品而造成色谱柱堵塞的经历，但是一旦浑浊的样品经过离心后，取不再浑浊的样品进样，色谱柱堵塞的问题也解决了。

使用在线过滤器

我深信在线过滤器是HPLC或UHPLC仪器上最有经济效益的部件。在线过滤器放置在自动进样器和色谱柱（或是保护柱）之间，常用的在线过滤器分为含有可替换筛板（0.5 μm或0.2 μm）的不锈钢在线过滤器以及一次性的PEEK材质的在线过滤器，一般必须选择比柱筛板孔径更小的筛板，这样才能有效拦截可能堵塞色谱柱筛板的颗粒。一旦发现仪器的压力开始增加，可能在线过滤器筛板开始堵塞了，我们必须在其被完全堵塞前更新。

在线过滤器的功能就如同使用滤膜一样，但是不需要任何额外的工作。使用离心机处理样品后，还是有可能会有少许的颗粒进入仪器，而位在色谱柱前面的在线滤器就可以将残留颗粒拦截下来。此外在线滤器的好处是简单易换，一般只需要5分钟就可以换好，就可以重新开机使用，也不需要花时间重新调节或是校正。另外一个好处就是在线过滤器也可以过滤掉仪器中一些零配件老化耗损所产生的颗粒。我是非常的主张每台液相仪器都装配在线过滤器，即使使用保护柱，我也建议在保护柱前加装在线过滤器。

使用保护柱

保护柱可以简单的说是装在色谱柱前面的一支短的色谱柱。一般是1-2 cm长，装的填料和使用的色谱柱填料相匹配，而使用的筛板孔径不会比色谱柱中使用的筛板孔径大。保护柱有两种功能：（1）可以阻挡可能堵塞色谱柱的颗粒；（2）因为保护柱和色谱柱填料相匹配，任何可能和色谱柱填料产生不可逆作用而不出峰的化学杂质，会被保护柱先行捕获。

使用保护柱绝对可以延长色谱柱的寿命。但是考虑是否使用保护柱前，建议评估以下几点：

（1）保护柱也不便宜，所以要考虑购买保护柱的费用是否能由所增加的色谱柱寿命补偿回来；

（2）保护柱的寿命有多长？必须注意何时需要换保护柱芯，不要因为更换太晚而污染到色谱柱；

（3）如何冲洗保护柱？冲洗时需要将保护柱和色谱柱分开冲洗，以免将累积在保护柱内的不纯物冲洗到色谱柱中；

（4）不要期望因为加了1-2 cm的保护柱而会增加柱效。装上保护柱虽然类似增加柱长，但是使用保护柱也增加了两个接头和连接管路，这些会造成仪器系统柱效减少，因此如果能维持不装保护柱时的柱效就不错了。

毋庸赘言，使用保护柱肯定可以延长色谱柱的寿命，但是建议每个实验室在经济效益和工作量方面来评估是否需要使用保护柱。即使使用保护柱，我也会建议在保护柱和自动进样器之间装个在线滤器，毕竟更换在线滤器比更换保护柱便宜，也可以同时增加保护柱和色谱柱的寿命。

总结：虽然色谱柱不可能永远不坏，但是我们可以采纳一些简单的方法来延长色谱柱的寿命。首先，即使样品需要前处理，建议最后一步可以再使用过滤或是离心进一步处理样品；其次，使用在线滤器或是保护柱来保护色谱柱，可以拦截样品中或是仪器本身产生的颗粒；第三，根据自己的分析物来评估是否值得使用保护柱；最后，记得在每一次分析结束后，使用强溶剂将被色谱柱保留的杂质冲洗出来。

参考文献

（1）John W. Dolan, LCGC North America, 32 (12), 916 - 920(2014)

（2）R.E. Majors, LCGC North America, 30(1),20–34 (2012).