色谱方法开发时，一般选择常用的试剂、pH条件、缓冲盐、以及常用色谱柱的组合作为起始条件，然后对流动相比例进行一系列调整，直至获得比较满意的峰形和分离效果，如何正确科学地选择液相流动相呢？

液相流动相选择原则

原则1：由强到弱

 一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。

原则2：三倍规则

每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。

原则3：粗调转微调

当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。

小问题

在配制流动相时我会遵循以上原则来加入一些添加剂来调节pH，常见的pH调节剂和缓冲盐对到底有哪些呢？

他们能够控制的pH范围又是多少呢？调节剂又应该从何说起？

常见的流动相

酸类 

甲酸：通常使用的浓度在0.5%以下，能够让水的pH达到二点几的级别。

乙酸：酸性比甲酸略弱，通常使用浓度不超过0.5%，能够使水的pH到达到二点几的级别。

三氟乙酸：比较强的酸，使用浓度通常不超过0.5%，能使水的pH达到2以下，具有很大的离子强度及一定的离子对作用，是分析蛋白/多肽时常用的添加剂。

磷酸：这是一种不挥发性的酸，离子强度也不错，最重要的是，它在低波长紫外区无本底吸收。

缺陷

在于低波长下的紫外吸收，通常不建议在小于215nm波长的情况下使用，另外就是甲酸/乙酸具有比较大的挥发性，时间久了浓度会发生变化；而磷酸的缺点也不少比如不能兼容质谱方法，对色谱柱寿命影响大等。除此之外，还有一些其他的酸，比如硫酸，盐酸或者柠檬酸，但是都是非常罕见的使用了。

碱类 

碱类添加剂常见的是氨水和三乙胺，两者都能让水的pH到达非常高的水平，高到能把硅胶颗粒溶解掉。

缺陷

氨水和三乙胺的pH非常高，使用时必须要谨慎，另外就是这两种溶剂通常不太容易很干净，尤其是三乙胺，即使是色谱纯，放的久了也可能会由于变质导致污染。

盐类

甲酸盐：通常在液相色谱中常用的甲酸盐都是甲酸铵，而甲酸盐与甲酸配合，可以得到甲酸-甲酸铵缓冲体系，大概缓冲能力在pH3～4.5的范围之内，只要调节两者浓度的比例即可。

乙酸盐：常见为乙酸铵，在使用上，和甲酸盐十分类似，离子强度也不高。与乙酸配合的乙酸-乙酸铵缓冲体系pH的控制能力在pH4～5.5左右。

磷酸盐 ：常用的是磷酸的钠盐和钾盐，二者对pH的控制能力十分接近，只是离子强度稍有差异，绝大多数情况下是可以互换使用的，磷酸由于是多元酸，能够形成一氢盐和二氢盐，所以使用磷酸缓冲体系调节pH也是组合比较多，跨度比较大的，并且可以提供较高的离子强度。

磷酸-磷酸二氢钠：pH1.2～3.1左右的范围；

磷酸二氢钠-磷酸氢二钠：pH6.5～8左右的范围。

缺陷

甲酸盐：离子强度比较低，比较容易吸潮，称量的时候比较困难，在流动相里还可能挥发。

磷酸盐：流动相体系无法兼容质谱，并且对色谱柱损伤较大。

最后，比起单纯的酸碱，盐类，特别是具有缓冲能力的盐类可以很好的控制流动相的pH值，根据不同缓冲盐中两种盐的配比，可以很容易的配置出一定pH的缓冲溶液。上述的缓冲对能调节的pH范围指的都是在保持缓冲能力的范围之内，如果仅仅是调节pH的话，范围还可以再扩展一些。

此外，当分析物含有可电离官能团时，（在不同pH条件下可处于不同程度的电离状态，如伯、仲、叔氨基、羧酸基），pH条件将强烈影响分析物的反相保留状态，也会造成最强烈的选择性改变效果。

对于可电离的化合物，要获得最强的反相保留，分析物应尽可能的不带电或电离，此时分析物极性相对较小，在反相色谱柱上的保留就更强，中性化合物无任何可电离基团，不受pH影响。

酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反向保留最大，中性化合物的保留不受pH影响。

在选择流动相时，应避免在化合物分子的pKa值附近筛选pH条件，否则，pH值的微小变化都会导致保留和选择性的剧烈变化。保留曲线的平台区是分析方法耐用性较强的区域。流动相中有盐时，应确保盐不会析出。

采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。