在硅胶上或杂化基质颗粒上键合了如C18、C8、C4或苯基等键合相的色谱填料所装填的色谱柱，按反相色谱条件进行操作和分离。反相是液相色谱中最常使用的分离模式，而C18柱是最常使用的反相色谱柱之一。

新色谱柱的活化与柱效测试

拿到一根新的色谱柱，首先要做的事情是查看色谱柱的说明书，了解色谱柱的基本信息，包括pH值范围、最高操作温度、最大操作压力等信息，再查看色谱柱柱效测试报告，准备柱效测试所用分析物及试剂，然后按以下步骤进行色谱柱活化及柱效测试：

1 液相连接二通，使用新鲜经过滤的水和乙腈或甲醇（根据测试报告中的流动相选择有机溶剂）冲洗液相系统，确保液相系统干净，不含任何缓冲盐和污染物。

2 将色谱柱入口端连接到液相系统上，柱出口端先不连接检测器，应直接连到废液收集器；色谱柱上有箭头标明正确方向，取用色谱柱时避免磕碰掉落。

3 在0.1ml/min流速下用乙腈（甲醇）或保存溶剂润洗色谱柱，最少2小时，或按照色谱柱说明书上的方法进行活化。

4 参照柱效测试报告中的方法，更换柱效测试所用流动相，缓慢调节流速至柱效测定流速，平衡色谱柱，至少5-10倍柱体积流动相（例如：250×4.6mm 的色谱柱柱体积为 4.2 ml，以 1 ml/min 流速10倍柱体积需要平衡 42 分钟），直至压力和基线稳定。

常见色谱柱柱体积汇总表

5参照柱效测试报告中的方法测试柱效，如果测试结果略低于测试报告，属于正常情况，如果结果明显偏低、峰形拖尾，说明所使用的色谱柱或液相系统处于非理想状态，需要进行排查。

6 记录测试方法及结果，并作为定期柱效测试的参考值。

色谱柱的使用

1了解色谱柱的使用限度，避免流动相pH、柱温、柱压等超过色谱柱的使用上限，缩短色谱柱使用寿命或损坏。

2 流动相必须过滤和脱气，每过24h-48h就应新配水相流动相，并同时更换或清洗流动相溶剂瓶，以避免流动相长菌。

3 再使用流动相平衡色谱柱之前用5%-10%甲醇（乙腈）冲洗系统及色谱柱，确保系统及色谱柱中没有缓冲盐或较高的有机相，避免缓冲盐遇较高浓度的有机相析出。

4 开始进样前，用20倍柱体积的起始流动相条件进行平衡；没有充分老化平衡的色谱柱，将会出现柱效较低、以及保留时间漂移的问题。如果使用梯度条件，每次梯度之间，用8-10倍柱体积的起始流动相条件再次平衡。

5 若使用双通道在线混合流动相，预先检查流动相各组分的兼容性，例如磷酸盐缓冲液与高比例乙腈（≥70%）混用时，可能发生盐析出。

6 确保样品不含颗粒性杂质，如果样品过脏，或有微粒微粒存在，需要更换适合的样品制备方法，再使用样品过滤器时确保过滤膜与样品溶剂不相溶，也可以考虑高速离心方法去除颗粒，例如8000转数以上离心20分钟，移取上清液进样。

7 确保样品溶液与流动相兼容，进样后不会发生沉淀，或溶剂不相溶情况。通常使用流动相或比流动相洗脱强度弱的流动相（即有机溶剂比例较低），溶剂或稀释样品，这样可以获得最好的峰形和检测灵敏度。

8 每次启动泵时，应将流速缓慢升高，避免直接从方法规定的流速启动泵（如从 0.1ml/min启动泵，每次升幅为0.1ml/min）。

9 分析过程中，每针或间隔数针使用空白溶液清洗柱内可能累积的污染物，分析结束后采用高比例水相除去柱内缓冲盐，再采用高比例有机相除去柱内的污染物。

10 检测完成后，建议每8个小时后，将流动相中乙腈的比例升高至 60％冲洗色谱柱45分钟（此时不需要将含有离子对的缓冲盐溶液换成水，保持柱温 45℃或适合的较高温度）；应对色谱柱进行彻底清洗，先用 10：90 乙腈（或甲醇）：水（体积比）冲洗色谱柱30分钟（根据缓冲盐或离子对的浓度调整冲洗时间），然后用高比例乙腈或甲醇冲洗 30-60分钟。

11 色谱柱保存于高比例有机相中（乙腈或甲醇），如长期不使用色谱柱需将色谱柱保存在说明中要求的保存液中，并定期对色谱柱进行活化，以避免色谱柱中的保护液干涸。

12 在色谱柱使用过程中，定期进行柱效测试，记录塔板数及压力，追踪监控色谱柱的性能变化；如发现色谱柱柱效下降，需进行柱效测试进行确认，再生后再测试柱效以确定再生效果。

13 当使用2.1mm色谱柱时，建议优化系统，以减少谱带展宽（谱带扩展体积不得超过20-40μl），包括使用检测器微量流通池、减少进样器LOOP环体积、使用较小内经（如0.12mm）的系统管路,并确保色谱柱与管路连接恰当，无死体积。

14 使用小颗粒填料（如2.5μm）短柱进行快速分离时，需要考虑以下因素：

a. 确保管路与色谱柱连接恰当，无死体积，尽量优化系统减少谱带展宽；

b. 提高采样频率至10点/秒以上；

c. 较小粒径的色谱柱产生的柱压较高，而较小粒径要达到最优色谱效率所需的线速度较高，请根据所用LC系统的实际情况调节流速；

d. 可使用较高的柱温来补偿小颗粒造成的压力升高，例如40℃。

柱清洗与再生

保留时间漂移、压力升高，色谱柱峰形发生变化如出现严重拖尾、肩峰甚至峰分叉，分离度降低，这些都强烈提示色谱柱受到污染。可采用以下步骤处理：

1 如系统接有在线过滤器和保护柱，首先排查在线过滤器与保护柱，进行更新替换。日常操作中，当压力升高10%或柱效降低10%时，就应该考虑更换在线过滤器或保护柱。

2 使用高比例有机相进行冲洗（请注意避免盐析出、通常可用梯度升高法，然后维持在高比例甚至100%有机溶剂条件下）。此操作通常可洗去大部分污染物。

3 如有机溶剂清洗不能解决问题，可采用如下方法进行色谱柱清洗和再生。根据样品性质及你所了解的污染物性质选择清洗方法，用至少20倍柱体积的HPLC级溶剂清洗色谱柱，将流动相温度升至35-55℃可提高清洗效率。

注：

1 防止缓冲盐析出，非极性样品的冲洗，可以先用高比例异丙醇水冲洗。

2 除非确保您的系统与四氢呋喃和正己烷完全兼容，否则四氢呋喃或正己烷只有在色谱柱无法用反相有机溶剂如乙腈清洗干净时才考虑使用。降低流速及操作温度，并尽量减少系统在四氢呋喃和乙腈中的暴露时间。

4 可以考虑对色谱柱进行倒冲，特别是当问题表现为压力急剧升高，提示有颗粒型物质直接堵塞于色谱柱入口端筛板处时。操作时，将色谱柱倒接，并与检测器断开，使用低流速0.2ml/min,进行过夜冲洗，并封堵检测器入口及出口端以免溶剂挥干产生气泡。