1. 实验步骤

1.1 样本采集和处理

收集新鲜血液样本在4℃条件下离心（如3000~4000 × g,15 min），血浆则位于上层，形成清晰的分层，而血液中的其他细胞成分（如红细胞、白细胞、血小板等）沉淀到离心管底部。

将分离得到的血浆转移到新的无菌离心管中。如果不立即进行外泌体提取，可将血浆样本分装保存在-80℃冰箱中，冻融次数一般不超过2次，否则会降低血浆RNA的提取率。

1.2 外泌体的分离

1.2.1超速离心法（常用方法之一）

将血浆样本在4℃下进行第一次低速离心300 × g，10 min，去除血浆中的细胞碎片。

取上清液进行第二次离心2000 × g，10 min，进一步去除较大的颗粒，如血小板等。

将上清液转移到新的超速离心管中，在4℃，100000 × g，超速离心90 min，使外泌体沉淀在管底。

弃去上清液，保留外泌体沉淀，用RNase-free Water重悬外泌体。

1.2.2 试剂盒法（如基于聚合物沉淀的试剂盒）

根据试剂盒说明书，按比例将适量的沉淀试剂加入血浆样本中，充分混匀。

4℃孵育30 min或者过夜使外泌体沉淀。

1500 × g，离心30 min收集外泌体沉淀，弃去上清液，用Rnase-free Water重悬外泌体。

1.3 外泌体RNA的提取

1. 裂解外泌体

向含有外泌体沉淀的离心管中加入适量的裂解液，充分混匀，使外泌体裂解，释放RNA。

2. RNA提取操作步骤

1）试剂盒法提取

根据所选用的RNA提取试剂盒的具体步骤进行操作。将裂解后的样本转移到吸附柱中，4℃ 12000 × g，离心30 s，使RNA吸附在吸附柱上。

用洗涤液洗涤吸附柱，12000 × g，离心30 s，重复洗涤2次，去除杂质。

最后，向吸附柱中加入60℃预热的Rnase-free Water或洗脱液，静置2 min左右；

4℃ 12000 × g，离心1 min，收集洗脱下来的RNA溶液。

2）TRIZOL提取法

利用相分离的原理，向裂解后的外泌体样本中加入等体积的Trizol试剂，充分混匀。

室温静置5 min，使核酸蛋白复合物充分裂解。

然后，加入氯仿（Trizol体积的1/5），剧烈振荡30 s，室温静置10 min。

之后，4℃ 12000 × g，离心15 min，溶液分为三层，RNA在上层水相中。

将上层水相转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，冰上沉淀10 min。

4℃ 12000 × g离心10 min收集RNA沉淀。

配置75%浓度的乙醇洗涤RNA沉淀3次，4℃ 7500 × g离心5 min，小心弃去乙醇。在通风橱内干燥5~10 min也可将离心管倒扣在吸水纸上，离心管壁上无明显水滴即可，干燥时间过长可能会导致后续溶解RNA比较困难。

最后，用60~80 μL的RNase-free水或DEPC水溶解RNA，保存至-80℃备用。

2. 注意事项

2.1 样本采集与处理

采集血液样本时，避免溶血，通常使用含乙二胺四乙酸（EDTA）或者枸橼酸钠等抗凝血剂的真空采血管。

因为红细胞破裂会释放出大量的RNA酶，导致外泌体RNA降解。血浆样本在保存和处理过程中要避免反复冻融，每次冻融会导致外泌体的损失和RNA的降解，使用过程需在冰上融化。

2.2 防止RNA降解

整个操作过程要在无RNA酶的环境中进行。

使用经DEPC处理过的耗材（如离心管、枪头）和RNase-free Water。

操作要迅速，样本置于冰盒上，要避免样本长时间暴露在室温下，尤其是在裂解外泌体后，因为RNA酶在室温下活性较高。

2.3 外泌体分离方法的选择与优化

超速离心法虽然是分离外泌体的经典方法，但对设备要求高，操作较为复杂。

如果采用试剂盒法，要根据样本类型和实际情况选择合适的试剂盒，并通过预实验进行优化。

不同的外泌体分离方法可能会对后续RNA提取的质量和产量产生影响，要综合考虑分离效率和RNA完整性。

2.4 RNA提取质量检测

提取得到的RNA要进行质量检测，如通过琼脂糖凝胶电泳观察RNA的完整性，一般能够看到清晰的18S和28S条带，但方法容易导致RNA容易降解，使用的仪器、试剂均需要用DEPC水处理或者配置。

为了便利，通常直接使用Nanodrop微量分光光度计检测RNA的浓度和纯度，OD260/OD280比值应在1.8~2.0之间。

图1琼脂糖凝胶电泳 （created in snappgene）

在正常的RNA琼脂糖凝胶电泳结果中，从加样孔开始，向凝胶的正电极方向，会依次出现28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA的条带。

其中，28SrRNA的条带位置在离加样孔较近的地方，18SrRNA条带在28SrRNA条带的下方（即离加样孔稍远的位置），5SrRNA条带则离加样孔最远。

如果RNA质量较好，没有发生降解，28SrRNA条带的亮度应该是18SrRNA条带亮度的约2倍（即28S:18S约为2:1），且两条条带都比较清晰，没有明显的弥散现象。

这表明RNA的完整性良好，没有受到核酸酶等因素的破坏。

2.5 操作规范与安全

在进行超速离心等操作时，要严格按照离心机的操作规范进行，确保仪器安全和操作准确。

操作人员要佩戴手套和口罩，防止样本污染和自身接触有害物质例如Trizol试剂、异丙醇、氯仿或者氯仿替代物等均需要通风橱内操作。