《中国药品标准》杂志  第22巻  第5期

刘江1，2，吴海军1，陈兴福1

(1. 四川农业大学农学院，成都 611130；

2. 成都大学药食同源植物资源开发四川省高校重点实验室，成都 610106)

 

摘要：通过本草文献综述，梳理了黑豆作为药材使用的历史简况；并结合药化分析试验比较了不同籽重黑豆的化学成分和生物活性，对其化学鉴别、质量评价方法提出了新的商榷建议。推荐临床以百粒重小于18 g的小黑豆入药，建议新版《中国药典》明确以矢车菊素葡萄糖苷为对照品鉴别其真伪；采用高效液相色谱法检测其含量，并以此作为黑豆质量评价标准。

 

关键词：黑豆；中华人民共和国药典；大豆花色苷；异黄酮；鉴别标准

 

Discussionon identification method and quality evaluation standard of Traditional

Chinese Medicine “Heidou” in the Chinese Pharmacopoeia

LIU Jiang，WU Haijun， CHEN Xingfu

(1. College of Agronomy，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130， China；

2. Key Laboratory for Chemistry of Traditional Chinese Medicine， Chengdu University，Chengdu 610106，China)

 

Abstract： The brief history of black soybean (SOJAE SEMEN NIGRUM) as Traditional Chinese Medicine was reviewed based on literatures review. The chemical composition and biological activity were compared among black soybean seeds with different weight by chemical analysis methods.The new chemical identification and quality evaluation method for black soybean in the Chinese Pharmacopoeia were discussed. It is recommended that small black soybean (100-grain weight＜18 g) is appropriately admitted in the new edition of the Chinese Pharmacopoeia. Soybean anthocyanins can be used as a reference substance to identify the black soybean seed，and high performance liquid chromatography method is used for quality evaluation standard of black soybean.

 

Key words： black soybean; Chinese Pharmacopoeia;anthocyanin; isoflavone; identification method

 

黑豆为豆科Leguminosae大豆属Glycine植物Glycine max (L.) merr的黑色种子，是著名的药食同源植物[1，2]；黑豆与其他种皮颜色大豆(黄、棕、绿、杂色等)一样，均同属于Glycine max (L.) merr一种[1]，但其药用功效差异较大。一方面，因其高蛋白、高不饱和油脂含量，黑豆是重要的粮经作物；另一方面，黑豆含有丰富的异黄酮、花色苷等功能性成分，亦作为保健食品或传统药物在中国及东南亚地区均有长期、广泛的使用[3]。大豆及其制品的药用历史悠久，历代本草及农书文献中均有记载；其中，尤以黑豆药用价值最高，其性甘、平，归脾、肾经；具有益精明目，养血祛风，利水，解毒功能。用于阴虚烦渴，头晕目昏，体虚多汗，肾虚腰痛，水肿尿少，痹痛拘挛，手足麻木，药食中毒[2]。自《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)2010年版始，大豆黄卷(药材名：SojaeSemen Germinatum)与黑豆(药材名：Sojae Semen Nigrum)正式作为单列药材分别被《中国药典》收录[2，4]。但药用黑豆的来源、鉴别与质量评价尚存争议。本文梳理了黑豆在历代本草中的施用情况并结合现代药化分析试验结果，提出了黑豆鉴别方法的商榷及质量评价标准建议，以求为黑豆药材的药典标准更新提供参考。

 

1 大豆及黑豆药用的本草考证

 

大豆药用记载始于《神农本草经》[5]：“生大豆：涂痈肿，煮汁饮，杀鬼毒，止痛……”；三国·曹魏吴普所著《吴普本草》[6]米食类记载：“生大豆，神龙、歧伯：生温熟寒，九月采，杀乌头毒……”；梁·陶弘景《名医别录》[7]：“生大豆：味甘，平，逐水胀，除胃中热痒，伤中，淋露，下癖血，散五藏结积，内寒，杀乌头毒。久服令人身重，熬屑，味甘，主治胃中热，去肿，除痒，消谷，止腹胀……”；唐·苏敬《新修本草》[8]米部卷第十九：“生大豆：味甘，平。涂痈肿，煮汁饮，煮饮汁，杀鬼毒，止痛……”。唐·孙思邈《千金翼方》[9]卷四米谷部：“生大豆，味甘，平。涂痈肿。煮汁饮，杀鬼毒，止痛，逐水胀，除胃中热痹，伤中淋露，下瘀血，散五脏结积，内寒，杀乌头毒……”。从秦汉三国到汉唐时期，历代本草均有关于大豆药用的记载，不难看出，其功能主要以大豆蛋白中和乌头毒性为主，也兼有利水、消胀等功效。

 

在历代药用实践中，黑豆因其独特的药效，逐渐从大豆中独立出来，成为一味特殊的药材，如：《本草纲目》[10]第二十四卷谷部三记载：“大豆有黑、青、黄、白、斑数色，惟黑者入药，而黄、白豆炒食作腐，造酱榨油，盛为时用，不可不知别其性味也”；“时珍曰：按：《养老书》云：李守愚每晨水吞黑豆二七枚，谓之五脏谷，到老不衰。夫豆有五色，各治五脏。惟黑豆属水性寒，为肾之谷，入肾功多，故能治水消胀下气，制风热而活血解毒，所谓同气相求也”。中医认为，黑豆性味甘、平，入脾肾经，有补肾益阴、健脾利湿、祛风除痹、解毒之功。清·张璐《本经逢原》[11]卷三谷部：“入肾经血分，同青盐、旱莲草、何首乌蒸熟，但食黑豆，则须发不白，其补肾之功可知。今人以制何首乌，取以引入肾经也”。

 

在本草施用过程中亦逐步衍生出对黑豆大小形态的描述性区别，并以此探讨其药效差异。北宋·苏颂《本草图经》[12]米部卷第十八：“生大豆有黑白二种，黑者入药，白者不用。其紧小者为雄豆，入药尤佳……”；明·倪朱谟《本草汇言》[13]卷之十四谷部菽豆类：“零乌豆又名马料豆。味甘、苦、咸，气寒，无毒。陈氏曰：零乌豆，即黑豆之形扁者，非黑大豆之黑而粗。又非穭豆之黑而细也”；明·陈嘉漠《本草蒙筌》[14]卷之五谷部：“生大豆：味甘，气平。无毒。原产泰山平泽，今则处处有之。黑白种殊，性取黑者入药；大小颗异，须求小粒煎汤。（自注：紧小者为雄豆，入药方效）。”由此可以看出，大量的传统医药实践表明，小粒黑豆的药效更强。

 

2 大豆来源药材在药典中的收录情况

 

黑豆在历代本草中均有收录，2005年版《中药大辞典》更是将“黑大豆”、“黑大豆叶”、“黑大豆皮”、“黑大豆花”分条单列[15]，并分别注释其不同的功效。而自2010版《中国药典》起才正式将“黑豆”列入一部“药材和饮片”中，与其同时列入的大豆来源药材还有“大豆黄卷”；后续各版药典中关于大豆黄卷与黑豆药材的描述均完全一致[2，4]。两味药材基原均为豆科植物Glycine max （L.）merr，其中，大豆黄卷为大豆经发芽干燥的炮制加工品，而黑豆为大豆的黑色干燥成熟种子。

 

详细比较上述两味药材的鉴定方法可知，大豆黄卷的两项鉴别方法均采用了薄层色谱法，包括对两类目标成分的比对检定：一是以氨基酸为检定目标，采用稀乙醇超声提取样品，以亮氨酸为对照品，以茚三酮显色对照标准药材鉴别；二是以大豆异黄酮为检定目标，采用80%乙醇超声提取样品，以染料木苷为对照品，以2%三氯化铝显色对照标准药材鉴别。而黑豆药材的鉴别方法则采用了粉末显微鉴定与薄层色谱法两种方式：一是以粉末颜色、种皮栅栏细胞、子叶糊粉粒和脂肪油滴及草酸钙结晶为特征的物理鉴定；二是以大豆异黄酮为检定目标，采用大豆苷和大豆苷元为对照品，以紫外灯254 nm检视，与标准药材对照鉴别[2]。由此可见，《中国药典》对这两味药材的化学鉴别均采用了以大豆异黄酮为对照品，正相薄层色谱比对的方法。

 

此外，《中国药典》中也注明了大豆黄卷的含量测定方法，主要是以70%甲醇回流提取样品，以大豆苷和染料木苷为对照品，采用高效液相色谱法梯度洗脱定量分析，以大豆苷和染料木苷的总量不低于0.08%为正品。而黑豆药材尚缺乏具体的化学质量评价标准[2]。

 

3 不同类型黑豆化学成分及生物活性比较

 

通过对历代本草的梳理，可以看出，小粒黑豆具有更强的药效，为此，我们搜集了40余个市售黑豆品种，对其百粒重进行了考察[16]。根据《中国农业百科全书》中有关中国大豆品种分类标准，按照籽粒重量将其分为大粒（百粒重18 g以上），中粒（百粒重12～17.9g）、小粒（百粒重11.9 g以下）三类[17]；本研究的供试黑豆材料中，共有16个大粒黑豆（最大百粒重为40.3g）、13个中等黑豆（平均百粒重15.6 g）、11个小粒黑豆（最小百粒重为5.5g），三者彼此间的百粒重均呈现极显著差异（图1）。

 

同时，我们采用液相色谱质谱联用法，定量分析了上述黑豆材料的4类异黄酮（异黄酮苷元(E)、葡萄糖糖苷（G）、丙二酰基异黄酮苷(M)、乙酰异黄酮苷(A)[18]、8种花色苷[飞燕草素半乳糖苷(DEA)、飞燕草素葡萄糖苷(DEL)、矢车菊素半乳糖苷(CYA)、矢车菊素葡萄糖苷(CYL)、天竺葵素葡萄糖苷(PEL)、矮牵牛色素葡萄糖苷(PET)、芍药色素葡萄糖苷(PEO)、矢车菊素(CYC)][19]含量；采用气相色谱质谱联用法定量分析了5种脂肪酸[棕榈酸(PA)、硬脂酸(SA)、亚油酸(LA)、油酸(OA)、亚麻酸(ALA)]含量；此外，我们还分析了总蛋白质（T-Pro，凯氏定氮法）、可溶性蛋白（S-Pro，考马斯亮蓝法）、可溶性多糖（S-Pos，硫酸苯酚法）[20]等主要化学成分含量及四类抗氧化活性【亚铁还原能力(FRAP)[21]、羟基自由基清除活力(·OH)[22，23]、二苯代苦味酰基自由基清除活力(DPPH)[19]、活性氧清除活力(ORAC)[21]】。

 

并基于上述多元化学及活性指标，对籽粒大小不同的三类黑豆进行了正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。结果发现，CYL、PEO、PEL等花色苷含量及其总量T-AC在小粒黑豆中的含量最高，其DPPH、FRAP抗氧化活性也最高；中等黑豆中G、M、A异黄酮及其总量T-IF，PET、CYA、DEL等花色苷含量较高，其ORAC、·OH自由基清除活力也较高（图2）。总体上可以看出，小粒到中等大小黑豆的黄酮类成分含量及其抗氧化活性均较高，这与历代本草中记载的药用黑豆的描述一致，即：“紧小者为雄豆，入药方效”。

注：不同大写字母间表示不同籽粒大小样本间差异极显著，P＜0.01）（The different capital letters above bars indicate significant differences among soybean seeds with different weight，P＜0.01）

图1  不同粒重黑豆百粒重比较[16]

Fig.1  100-grain weights of black soybean seeds

 

图2  正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）得分图（A）与载荷图（B）[16]

Fig.2  OPLS-DA score plot （A） and corresponding loadings scatter plot （B） ofblack soybean seeds with different weight

 

4 黑豆鉴别方法的商榷及含量测定建议

 

4.1 《中国药典》黑豆鉴别方法的商榷依据

 

现行版《中国药典》中关于黑豆的化学鉴别，主要以大豆异黄酮为检定目标，采用大豆苷和大豆苷元为对照品，与标准药材进行薄层色谱对照鉴别。该鉴定方法有如下几点值得商榷：一是与《中国药典》收录的另一味药材“大豆黄卷”的鉴别方法基本一致[2]，不同的两味药材采用几近一致的鉴别方法，值得商榷；而大量文献表明，大豆籽粒中异黄酮含量以葡萄糖糖苷（G）和丙二酰基异黄酮苷（M）为主，二者占到大豆异黄酮总量的80%以上，而异黄酮苷元（E）含量甚微[18]，以微量异黄酮苷元为对照品比对的做法，有失偏颇。

 

二是根据现代药化分析结果（图3），小粒黑豆与中粒黑豆的花色苷含量无显著差异，但均达到3.0 mg·g-1以上，且极显著高于大粒黑豆花色苷含量（1.8 mg·g-1）；结合传统本草记载不难看出，传统中医所用黑豆应为花色苷含量极高的中小粒黑豆（百粒重＜18 g），并非大粒黑豆，其鉴别方法应以花色苷为检定对象，而非异黄酮；栽培大豆种皮具有多种颜色，药典仅收录了黑色种皮之黑豆入药，与其他颜色大豆相比，其植物基原均为Glycine max （L.）merr，均可检出不同程度的异黄酮含量[24]，黑豆有别于其他颜色大豆的重要特征应是其黑色素类化合物--花色苷。

 

注：不同大、小写字母间表示不同籽粒大小样本间差异显著（P＜0.01或0.05）。[Note：different upper case/lower case letters above bars indicate significant differences among soybean seeds with different grain sizes，P＜0.01 or0.05)]

图3  不同籽粒大小黑豆花色苷含量比较[16]

Fig.3  The content comparison of anthocyanin in black soybean seeds

 

第三，黑豆花色苷与其中医临床功效密切相关[25]，现代药理研究也表明，基于黑豆消除自由基活性，其具有抑制细胞损伤[26]、抗炎[27，28]、抗肿瘤[29]、预防糖尿病[30]等多方面的药用功效；在黑豆种皮中大量积累的大豆花色苷作为强氧化抑制剂，其抗氧化活性显著高于异黄酮[3]，是黑豆有别于普通黄豆特有的主要药效成分，其含量约占黑豆干重的1%～2%。

 

第四，本文重点在于鉴别正品黑豆药材；抗氧化活性固然无法完全涵盖黑豆的功能主治，但从中医基础理论讲“豆乃肾之谷，黑色属水，水走肾…”，即黑色种皮是黑豆作为中药使用的重要特征，而花色苷类成分是其黑色的唯一来源，因此，花色苷既可作为鉴别成分，也可用作质控标准，

 

另外，在现实生活中，黑豆因其具有较高的功能活性和保健价值，相较于黄豆而言，黑豆价格远高于普通黄豆，因此，不乏有不法商贩以黄豆染色冒充黑豆的现象出现。若采用现行鉴别方法，以大豆异黄酮为检定指标，难以鉴别类似伪品，因而采用花色苷为检定目标，也具有重要的现实意义。

 

4.2 黑豆鉴别方法及含量测定建议

 

正品黑豆药材花色苷类化合物的含量极高，其主要以糖苷形式存在，主要包括飞燕草素半乳糖苷、飞燕草素葡萄糖苷、矢车菊素半乳糖苷、矢车菊素葡萄糖苷、天竺葵素葡萄糖苷、矮牵牛色素葡萄糖苷、芍药色素葡萄糖苷等8种单体化合物；其中以矢车菊素葡萄糖苷的含量最高[19]，占到总花色苷含量的90%以上；而矢车菊素葡萄糖苷在其他植物体内广泛分布，单体化合物纯品容易获得，商品化标准品价格较低，以其为对照品可实现正、伪品黑豆的有效鉴别。

 

大豆花色苷在自然状态下主要以离子态形式存在，其水溶性极好、极性较大，受温度、光和pH值等环境因素的影响而极易降解（酸性环境中相对稳定）[31]。结合相关文献报道[19，32]，建议使用盐酸-80%甲醇水溶液（1∶99）为提取溶剂，采用反相薄层色谱法，以“甲醇-水-甲酸”为展开剂，或采用正相薄层色谱法，以高极性“氯仿-甲醇-水”为展开剂，以矢车菊素葡萄糖苷为对照品鉴别[32]。

 

同时，黑豆药材的含量测定方法可参考已有文献[32]，建议采用高效液相色谱法，以矢车菊素葡萄糖苷为对照品，使用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以10%甲酸水溶液-甲醇/乙腈/水/甲酸（22.5/22.5/40/10，V/V）混合系统为流动相梯度洗脱；以520 nm紫外检测[33]或电喷雾离子源质谱检测[34]。结合已有文献报道及本文实践，建议按干燥品计算，以花色苷总量不低于2.0 mg·g-1为黑豆药材的质量评价标准。

 

5 小结

 

黑豆在历代本草中均有大量药用记载，其植物生源地域分布广泛，与普通百姓的生活密切相关，是典型的药食两用植物。自《中国药典》2010版收录黑豆药材至今的数年间，黑豆伪品时有出现，现行《中国药典》鉴别方法的适用性值得商榷。本文结合历代本草中关于黑豆形态、功效的描述，并结合现代药理药化分析，指出传统药用黑豆应为花色苷含量较高的小粒黑豆，建议新版《中国药典》采用以矢车菊素葡萄糖苷为代表的大豆花色苷作为正品黑豆药材的对照品，以实现黑豆药材的正品鉴别与质量控制。

 

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