本文主要介绍了杭州诺辉健康科技有限公司研发的医疗器械“幽门螺杆菌抗原检测试剂（乳胶法）”的临床前研发实验。

一、幽门螺杆菌抗原检测试剂（乳胶法）的产品主要组成成分

本检测试剂由试纸条、塑料件（管型）、取样棒、样本稀释液组成；试纸上的主要成分有：包被用鼠抗 Hp 抗体、标记用鼠抗Hp 抗体、链霉亲和素、羊抗鼠 IgG、生物素、BSA、红乳胶颗 粒、硝酸纤维素膜。 样本稀释液主要成分：乙二胺四乙酸四钠水合物和氯化钠。

二、幽门螺杆菌抗原检测试剂（乳胶法）的产品预期用途

幽门螺杆菌抗原检测试剂（乳胶法）用于体外定性检测人粪便样本中幽门螺杆菌抗原。本产品用于幽门螺杆菌感染的辅助诊断，既适用于专业医务人员在医疗单位进行幽门螺杆菌抗原检测，也适用于消费者自测，不建议用于幽门螺杆菌根除治疗后人群进行自测。 

三、幽门螺杆菌抗原检测试剂（乳胶法）的产品包装规格

管型：1 人份/盒；管型：2 人份/盒（1 人份/袋×2）；管型：5 人份/盒（1 人份/袋×5）

四、幽门螺杆菌抗原检测试剂（乳胶法）的产品检验原理

幽门螺杆菌抗原检测试剂（乳胶法）采用双抗体夹心法，试剂含有分别被事先固定于膜上检测区（T）的鼠抗 Hp 抗体（VacA 抗原表位）和质控区（C）的羊抗鼠 IgG 和链霉亲和素，以及包被在聚酯膜上的乳胶标记鼠抗 Hp 抗体和乳胶-BSA-生物素偶联物。测试时，液体进入检测槽，随之在毛细效应下向上层析。 如样本中含有 Hp 抗原，首先会和包被在聚酯膜上的乳胶标记鼠抗 Hp 抗体形成抗原-抗体复合物，进而通过检测区（T）时会被固定在检测区（T）鼠抗 Hp 抗体所捕获，检测区（T）会出现一条红色条带，判定为阳性。如样本中不含有 Hp 抗原，则检测区（T）将不会形成双抗夹心复合物，因此检测区（T）内将没有红色条带出现，则判定为阴性。无论 Hp 抗原是否存在于样本中，乳胶-BSA-生物素在层析过程中会被固定在膜上的链霉亲和素结合，在质控区（C）会出现一条红色条带。质控区（C）内所显现的红色条带是判定层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。 

五、幽门螺杆菌抗原检测试剂（乳胶法）的主要原材料

1.主要原材料的选择 

本产品的主要原材料包括：鼠抗幽门螺杆菌单克隆抗体、羊抗鼠IgG多克隆抗体、链霉亲和素、红乳胶颗粒、生物素、硝酸纤维素膜，这些原材料均是通过外购的方式获得。 

诺辉健康对主要原材料进行了供应商的选择，通过功能性实验筛选出合格供应商，制定了各主要原材料的技术要求和质量标准并经检验合格。 

2.企业参考品设置情况

诺辉健康设计了完整的企业参考品，包括阳性参考品、阴性参考品、精密度参考品和最低检测限参考品。 

企业参考品由菌液和临床阴性样本制备而成。阳性参考品12份，由6种不同来源的幽门螺杆菌组成，包括不同浓度水平。阴性参考品20份，包括10份特异性菌株和10份临床阴性样本。 

精密度参考品18份，由6种不同来源的幽门螺杆菌组成，包括阴性、弱阳性和中等阳性水平。最低检测限参考品6份，由6种不同来源的幽门螺杆菌组成。

六、幽门螺杆菌抗原检测试剂（乳胶法）的生产工艺及反应体系研究 

诺辉健康通过对试剂主要生产工艺的研究，确定最佳的生产工艺。对试剂反应体系研究包含样本稀释液装载量、膜条宽度、参与反应的液体量、不同温湿度条件下的检测时间和判读时间、 加样量、样本混匀方式等，通过一系列研究，最终确定了最佳 的反应体系。 

七、幽门螺杆菌抗原检测试剂（乳胶法）的分析性能评估研究

本产品分析性能评估内容包括准确度、精密度、分析灵敏度、钩状效应、分析特异性（交叉和干扰）的研究，同时对水样便样本类型的适用性和粪便样本稳定性也进行了研究。申请人提交了有效运行的质量管理体系下生产的三批产品性能评估资料。 

在准确度性能评估中，诺辉健康使用阴性参考品、阳性参考品进行检测，结果显示检测结果与预期结果阳性符合率和阴性符合率均为 100%。使用不同地域临床菌株和临床阳性样本进行检测，结果显示阳性检出率为 100%。 

在精密度性能评估中，诺辉健康使用精密度参考品进行检测，结果显示精密度阴性参考品阴性检出率为 100%，精密度弱阳性参考品阳性检出率＞95%，精密度中等阳性参考品阳性检出率为 100%。使用精密度参考品（包括精密度阴性参考品 1 份，精密度弱阳性参考品 6 份，精密度阳性参考品 1 份），由四位实验 

人员在三个实验地点进行 20 天的检测，同时评估了日内、日间、人员间、批内、批间和地点间精密度，结果显示检测结果符合精密度性能要求，且色带显色强度差异均≤1 个档次色差。 

在分析灵敏度性能评估中，进行了最低检测限的确定和验证。通过对 7 种不同来源幽门螺杆菌配制成不同浓度的菌液，每个浓度检测 20 次，确定阳性检出率≥95%的最低浓度水平作为最低检测限，结果显示检测 7 种幽门螺杆菌时，最低检出限浓度都为 3×104 CFU/mL。采用三批试剂盒对最低检测限水平不同来源菌液分别重复检测 20 次，检测结果显示其阳性检出率都≥95%。采用三批试剂盒对于最低检出限蛋白量进行研究，结果表明检测与抗体对应表位的抗原蛋白最低检出限为 125 ng/mL。 

在交叉反应的性能评估中，诺辉健康采用 14 份浓度不高于1×107CFU/mL 的特异性菌株（普通变形杆菌、空肠弯曲菌、大肠埃希氏菌、白色念珠菌、粪肠球菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌、枯草芽孢杆菌、乙酸钙不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、奇异变形菌、福氏志贺菌和猪霍乱沙门氏菌）分别对三批试剂盒的特异性进行检测，结果显示阴性符合率均为100%，本产品与浓度不高于 1×107CFU/mL 的 14 份菌株不发生交叉反应。 

在干扰物质的性能评估中，使用 11 份不同浓度的干扰物质（抗坏血酸、脂肪、胆红素、雷尼替丁、奥美拉唑、粘液素、氢氧化钠铝、白细胞、法莫替丁、血红蛋白和枸橼酸铋钾），分别对三批试剂盒的干扰浓度进行研究，结果显示当抗坏血酸＜20mg/dL、粘液素＜2000mg/dL、脂肪＜500mg/mL、氢氧化钠铝＜20mg/g、胆红素＜60mg/dL、白细胞＜10000 个/ mL、雷尼替丁＜2mg/g、法莫替丁＜2mg/g、奥美拉唑＜2mg/g、血红蛋白＜20mg/g、枸橼酸铋钾＜3mg/g（相当于 1.1 mg/g 铋）时，干扰物质对试剂盒检测结果无明显影响。 在钩状效应性能评估中，诺辉健康采用幽门螺杆菌菌悬液进行稀释，每个梯度的稀释液重复 3 次，绘制钩状效应曲线图，产品信号强度随着幽门螺旋杆菌浓度的先升高后平稳，在平稳 

期随着幽门螺杆菌浓度的升高却未发现信号强度下降的现象，1×108CFU/mL 幽门螺杆菌浓度是临床上细菌感染水平（106CFU/mL）的 100 倍时，产品仍未发生钩状效应。结果表明在幽门螺杆菌浓度≤1×108 CFU/mL 时不会因为产生钩状效应而影响本产品的检测性能，导致假阴性结果的出现。诺辉健康对粪便样本的稳定性进行研究，研究结果表明粪便样本常温可保存 6 小时；2～8℃下可保存 72 小时；-25～-15℃冷冻储存可保存 6 个月，样本最多能反复冻融 3 次。 

诺辉健康使用一批次试剂对水样便的适用性进行验证，实验结果表明，水样便类型样本对本产品的检测性能无影响。 

八、幽门螺杆菌抗原检测试剂（乳胶法）的阳性判断值研究

诺辉健康使用临床上诊断明确的 200 例粪便样本（尿素呼气试验（UBT）阳性 94 例、阴性 106 例）对阳性判断值进行研究，通过临界值研究确定本试剂临界值为 3×104 CFU/mL。研究结果 显示，申报产品与 UBT 结果比对，灵敏度为96.8%，特异性为97.2%，总符合率为 97.0%，Kappa 值为 0.92。使用本试剂盒和已上市同类产品同时对临床样本进行检测，结果表明本试剂与对比试剂和UBT 检测结果显示了高度的一致性。经过验证确定阳性判断值为 3×104 CFU/mL。 

九、幽门螺杆菌抗原检测试剂（乳胶法）的稳定性研究

诺辉健康对本产品的稳定性研究包括货架效期稳定性、开封稳定性、运输稳定性，确定了各种条件下本产品的有效保存时间，所用试剂批号为 201804001、201804002、201805001。 货架效期稳定性：采用三批试剂进行研究，试剂保存在 2～ 30℃条件下，分别于保存第 0 个月、3 个月、6 个月、9 个月、 12 个月、13 个月时取出试剂盒，对试剂盒的阴阳符合率、精密度、最低检测限进行考察，各项性能指标均符合要求，但在 19～30℃条件下实际保存 250 天，综合考虑，确定产品在 2～25℃储存条件下，可稳定保存 8 个月。 

开封稳定性：随机抽取三批试剂，设置恒温恒湿箱的温度为 30℃、湿度为 90%，打开试剂铝箔袋，放入恒温恒湿箱保存分别在铝箔袋打开 1h 和 1.5h 时取出，对试剂盒的阴阳符合率、精密度、最低检测限进行考察，各项性能指标均符合要求，确定试剂盒铝箔袋打开后，在温度 15～30℃、湿度 20%～90%的 环境下，可保存 1 个小时。