新型冠状病毒（2019-nCoV）属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，直径约为60~140nm。具有5个必需基因，分别针对核蛋白（N）、病毒包膜（E）、基质蛋白（M）和刺突蛋白（S）4种结构蛋白及RNA依赖性的RNA聚合酶（RdRp）。核蛋白（N）包裹RNA基因组构成核衣壳，外面围绕着病毒包膜（E）,病毒包膜包埋有基质蛋白（M）和刺突蛋白（S）等蛋白。
实验室检查包括一般检查，病原学及血清学检查，胸部影像学检查等。病原学检查又包括核酸检测和抗原检测。核酸检测主要采用逆转录PCR，二代测序等方法，在鼻、口咽拭子、痰液和其他下呼吸道分泌物等标本中均可检测出新型冠状病毒核酸。
新型冠状病毒在流行过程中基因组不断发生变异，新的变异株可能在传播力、致病性、免疫逃逸能力等方面发生改变。变异株可能影响检测试剂的性能，甚至出现漏检。
本文适用于采用逆转录实时荧光 PCR法，对咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液或痰液等呼吸道样本中的新型冠状病毒(2019-nCoV )核酸进行体外定性的检测试剂。
根据《体外诊断试剂分类规则》，该产品按照第三类体外诊断试剂管理，分类编码为6840。
一. 新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂性能研究实验要求
1. 分析性能研究
开发人应采用在符合质量管理体系的环境下生产的试剂盒进行所有分析性能研究，确定具体研究方法、试验方案、试验数据、统计分析等。
如产品适用不同的机型，需要对采用不同机型进行性能评估。如申报产品包含不同的包装规格，需要对各包装规格进行分析或验证。
适用的不同样本类型应分别进行分析性能研究。
1.1样本稳定性
考虑到病毒RNA极易被降解的特性，应对样本稳定性进行详细研究，包括采集后未经处理的样本，加入不同裂解液/消化液的样本，灭活处理后的样本，研究内容包括冷藏保存时间，冷冻保存时间，冻融次数等。
如产品适用拭子、痰液等不同的样本类型，因其中干扰物质存在较大差异，可能对病毒RNA降解的影响不同，建议对每种样本类型均进行稳定性研究。
如核酸提取液可不立即进行检测，还需对核酸提取液的保存条件和稳定性进行研究。
1.2适用的样本类型
明确产品适用的样本类型。
1.3企业参考品验证
根据主要原材料研究资料中的企业参考品设置情况，采用三批产品对企业参考品进行检验并提供详细的试验数据。
1.4精密度
应对精密度指标，如标准差或变异系数等的评价标准做出合理要求。应考虑运行、时间、操作者、仪器、试剂批次和地点等影响精密度的条件，设计合理的精密度试验方案进行评价。精密度评价试验应包含核酸提取步骤。设定合理的精密度评价周期，例如为期至少20天的检测。对检测数据进行统计分析，获得重复性、实验室内精密度、实验室间精密度、批间精密度等结果。
采用临床样本进行精密度评价，应至少包含3个水平：阴性样本、临界阳性样本、中/强阳性样本，并根据产品特性设定适当的精密度要求，例如：
阴性样本：待测物浓度低于检出限或为零浓度，阴性检出率应为100%（n≥20）。
临界阳性样本：待测物浓度略高于试剂盒的检出限，阳性检出率应≥95%（n≥20）。
中/强阳性样本：待测物浓度呈中度到强阳性，阳性检出率为100%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。
1.5包容性
1.5.1病毒样本的验证
验证具有时间和区域特征性的至少20个不同来源的阳性样本（临床样本或病毒培养物），应包括检出限和重复性的验证。样本应覆盖目前国内流行的变异株型别，并适当纳入其他代表性的变异株。注意包容性研究样本和检出限研究样本不能重复。
1.5.2生物信息学分析及人工合成样本的验证
按照器审中心另行公布的变异株验证相关要求进行评价。
1.6检出限
1.6.1检出限的确定
将不同来源的至少5个新冠病毒样本梯度稀释于与适用样本一致的基质中，进行检出限的确定。每个浓度梯度最少重复3次检测，以100%可检出的最低浓度水平作为估计检出限，在此浓度附近制备若干梯度浓度样本，每个浓度至少重复20次检测，将具有95%阳性检出率的最低浓度水平作为确定的检出限。
1.6.2检出限的验证
选择另外5个不同来源的新冠病毒样本在检出限浓度水平进行验证，应达到95%阳性检出率。
1.7分析特异性
1.7.1交叉反应
需验证相关病原体和多例人类基因组DNA（表1）的交叉反应。除SARS冠状病毒和MERS冠状病毒可采用假病毒外，各病原体均应采用临床样本或培养物进行验证。建议在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证。通常，细菌感染的浓度水平为106CFU/mL或更高，病毒为105PFU/mL或更高，明确所有用于交叉反应验证的病原体样本的来源、阴阳性、种属/型别和浓度等。
表1 需进行交叉反应验证的物质
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地方性人类冠状病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒 |
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H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季节性H1N1流感病毒、H3N2、H5N1、H7N9，乙型流感Yamagata、Victoria，呼吸道合胞病毒A、B型，副流感病毒1、2、3型，鼻病毒A、B、C组，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，肠道病毒A、B、C、D组，人偏肺病毒、EB病毒、麻疹病毒、人巨细胞病毒、轮状病毒、诺如病毒、腮腺炎病毒、水痘-带状疱疹病毒 |
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肺炎支原体、肺炎衣原体 |
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军团菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌 |
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烟曲霉、白色念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌等 |
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高浓度人类基因组DNA |
1.7.2竞争性干扰
开发人应充分考虑临床上容易与新冠病毒合并感染的病原体，在高浓度的情况下对低浓度（例如检出限浓度）新冠病毒核酸检测的影响，进行竞争性干扰研究。
1.7.3干扰试验
应根据所采集样本类型，针对可能存在的内源/外源物质干扰情况进行验证。在每种干扰物质的潜在最大浓度（“最差条件”）条件下进行试验，检测包含临界阳性水平在内的新冠病毒样本。对结果进行合理的统计分析，对比添加干扰物质前后的 Ct 值差异。检测的潜在干扰物包括样本中的原有物质及在样本采集和处理期间引入的物质。
表2 用于干扰试验的物质
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类别 |
具体物质 |
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粘蛋白 |
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血液（人类） |
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鼻腔喷雾剂或滴鼻剂 |
苯福林、羟甲唑啉、氯化钠（含防腐剂） |
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鼻用皮肤类固醇 |
倍氯美松、地塞米松、氟尼缩松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松 |
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缓解咽部症状的药物 |
相关含片、喷剂等 |
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过敏性症状缓解药物 |
盐酸组胺 |
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抗病毒药物 |
α-干扰素、扎那米韦、利巴韦林、奥司他韦、帕拉米韦、洛匹那韦、利托那韦、阿比多尔 |
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抗生素 |
左氧氟沙星、阿奇霉素、头孢曲松、美罗培南 |
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全身性抗菌药物 |
妥布霉素 |
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样本采集和处理期间引入的物质 |
1.8核酸（RNA）提取/纯化性能
在进行核酸检测之前，建议有核酸（RNA）提取/纯化步骤。该步骤的目的除最大量分离出目的RNA外，还应有相应的纯化作用，尽可能去除PCR抑制物。对配合使用的所有核酸提取试剂进行提取核酸纯度、浓度、提取效率的研究，并与质量较好的核酸提取试剂进行平行比对。若产品适用两种或以上核酸提取试剂，则每一种核酸提取试剂均需配合检测试剂进行抗干扰、精密度和检出限的验证。
1.9反应体系
1.9.1样本采集和处理
1.9.1.1样本采集方式的选择
1.9.1.2样本采集时间点的选择：是否受病程、临床症状、用药情况等因素的影响。
1.9.1.3采样拭子及样本保存液的选择：对拭子头和拭子杆的材质要求。明确保存液或裂解液的成分、浓度、使用量的要求等。配套的不同保存液或裂解液需验证检出限和重复性。
1.9.1.4样本处理方式的选择：研究产品适用的灭活方式，包括热灭活和化学灭活，研究内容包括胍盐的使用浓度及用量、样本用量。如适用，对痰液消化方式及消化液进行研究。
1.9.2核酸提取和反应体系
研究确定最佳核酸提取和反应体系，包括核酸提取用的样本体积、洗脱体积和PCR加样体积、各种酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度及反应各阶段温度、时间、循环数等。建议在保证核酸提取质量的情况下尽量扩大总反应体系和加样量，以提高检测灵敏度。
反应体系研究应确保不同基因的检测能力具有一致性，对于结果为单基因阳性时需要复测的试剂，需使用至少10例临床样本梯度稀释，观察各基因检出情况是否存在显著差异，避免过高的复测率。
确定不同适用机型基线和阈值循环数。
不同适用机型的反应条件如果有差异应分别进行验证。
2. 稳定性研究
申报试剂的稳定性主要包括实时稳定性（有效期）、开瓶稳定性及冻融次数限制等研究，开发人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。对于实时稳定性研究，应对至少三批产品在实际储存条件下保存至成品有效期后进行研究。
3. 阳性判断值研究
阳性判断值一般为申报产品检测病毒核酸阳性的Ct值。阳性判断值研究用样本来源应具有多样性和代表性，考虑不同时间、地域、不同的感染阶段和生理状态等因素，尽量纳入较多弱阳性和高阴性水平的样本。在条件允许的情况下，建议覆盖目前的流行株进行阳性判断值研究。采用ROC曲线分析建立每个检测靶基因的阳性判断值，然后确定产品的判读规则（单基因阳性、双基因阳性等）。对于结果为单基因阳性时需要复测的试剂，建议对阳性判断值研究数据进行复测率的统计分析。如判定值存在灰区，对灰区进行确认。
如果产品适用不同样本类型，需要对各样本类型进行阳性判断值的验证。
研究确定内标检测结果范围。
4. 其他研究
4.1主要原材料研究
该类产品的主要原材料包括引物、探针、酶、dNTP、核酸分离/纯化组分（如有）、质控品、参考品等。应确定主要原材料的选择与来源、制备过程、质量控制标准等相关研究、质控品的定值试验等。主要原材料可为企业自制也可源于外购。供应商应固定，不得随意更换。
4.1.1引物和探针：应明确引物、探针核酸序列、靶序列的基因位点及两者的对应情况。建议每种病毒设计两套或多套引物、探针以供筛选，通过序列比对和功能性试验等方式，对病毒进行包容性和特异性（如交叉反应）的评价，其中序列比对包括与已公布新冠病毒序列的比对，及与易产生交叉反应的其他病原体的序列比对；功能性试验包括对不同来源、不同滴度的新冠病毒核酸阳性样本，和不同的近缘病原体的检测。通过筛选确定最佳的引物和探针组合。引物、探针的质量标准应至少包括序列准确性、纯度、浓度及功能性实验等。
4.1.2脱氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，应对其纯度、浓度、功能性等进行验证。
4.1.3酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆转录酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，应分别对酶活性、功能性等进行评价和验证。
4.1.4质控品
试剂盒一般包含阴性质控品和阳性质控品。阳性质控品应包含试剂盒检测的靶序列，可采用假病毒制备。质控品需参与样本处理、核酸的平行提取和检测的全过程，以对整个提取和PCR扩增过程、试剂/设备、交叉污染等环节进行合理质量控制。对质控品的检测结果Ct值范围做出明确的要求。
4.1.5内标
内标，又称内对照，可对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，应与靶核酸一同提取及扩增。开发人需对内标的引物、探针设计和相关反应体系的浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线又要尽量降低对靶基因检测造成的抑制。明确内标的检测结果Ct值范围。建议科学设置内标，对待测样本的取样质量、试剂的反应体系进行监控。
4.1.6企业参考品
该类产品的企业参考品一般包括阳性参考品、阴性参考品、检出限参考品和重复性参考品。应根据产品性能验证的实际需要设置企业参考品。
企业参考品的设置建议如下：
阳性参考品：应着重考虑不同来源的病毒样本和滴度要求，应至少选取不同来源的5个病毒样本。
阴性参考品：主要涉及对交叉反应的验证情况，建议包括冠状病毒（HKU1、OC43、NL63、229E）、SARS冠状病毒（可采用假病毒）、MERS冠状病毒（可采用假病毒）、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。
检出限参考品：可采用95%阳性检出水平或略高于检出限的水平，如100%阳性检出水平。
重复性参考品：建议包括高、低两个浓度的样本，其中一个浓度应为检出限附近的浓度。
4.2生产工艺研究
明确产品主要生产工艺并进行优化研究。
