1. 实验原理

Transwell实验是一种用于研究细胞迁移和侵袭能力的体外实验方法。其原理是利用带有微孔的聚碳酸酯膜将实验装置分隔成上下两部分。上腔加入待测试细胞，下腔加入含有趋化因子的培养基，形成化学浓度梯度。

细胞在趋化因子的刺激下，通过变形穿过微孔到达下腔，从而模拟体内细胞的跨膜运动。实验者可以通过染色或计数迁移至下腔的细胞，评估其迁移或侵袭能力，该方法广泛应用于肿瘤转移、免疫细胞趋化和药物筛选等研究领域。

图1 transwell细胞迁移测定图[1]

2. 实验材料

耗材：Transwell小室、24孔板、培养皿、6孔板、棉签

试剂：无血清培养基、胎牛血清、胰酶、4%多聚甲醛固定液、结晶紫染液、PBS

设备：离心机、倒置显微镜、细胞计数仪、培养箱

3. 实验步骤

3.1 细胞培养与接种

将对数期生长的细胞铺于6孔板，如需要敲低某基因，则铺板密度控制在30%-40%左右；如需让某个基因过表达，则铺板密度控制在60%-70%左右。

3.2 细胞处理

细胞贴壁培养24 h后，根据实验设计进行相应处理，如可进行siRNA转染以干扰特定基因表达，或者通过质粒转染来过表达目的基因。

3.3 细胞收集与制备

处理结束后，消化细胞并进行离心收集，并用无血清培养基重悬。

细胞计数，一般每个Transwell小室接种5×104个细胞，但具体接种量需结合实验优化，如目的细胞长得很慢则需要适当多接种细胞，第一次试验时可在同一次实验中平行设计不同浓度来对比效果。

3.4 Transwell小室细胞接种与培养

将计数好的细胞重悬，准备24孔Transwell板，取100 µL悬滴加入Transwell上室，加入700 µL含20%FBS的完全培养基于下室，以建立稳定的趋化诱导环境，诱导细胞发生迁移行为。

然后轻轻将Transwell装置置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中孵育24或48h，具体培养时间可根据实验需求进行调整和优化（若实验需要加入药物刺激后看迁移结果，可给小室中加入适量药物）。

3.5 细胞固定与染色

培养结束后，取出Transwell小室，并用PBS清洗，随后，将小室转移到干净的24孔板中，并用4%的多聚甲醛和0.1%的结晶紫染液固定染色15 min。

染色后，再次用PBS清洗2遍，以去除多余染料，之后用棉签轻轻擦除Transwell上室未迁移的细胞，确保仅保留的是已穿透膜的细胞（可通过肉眼或显微镜观察上，如果没有明显的细胞团块或细胞聚集的迹象，且上室表面看起来相对干净、均匀，没有明显的深色，可判断未迁移细胞已被大部分清除）。

3.6 显微镜观察与图像采集

倒置显微镜拍照，将小室置于载玻片上，分别使用10X和20X物镜，从左至右依次拍摄多个视野，保存图片以备后续image J分析。

3.7 Transwell小室清洗

实验结束后，为了便于小室的重复利用，可对小室清洗和消毒：先用胰酶消化5 min，去除残留在小室的细胞；用75%酒精进行浸泡消毒，去除残留物；最后，放置于紫外线灯下照射消毒，以确保小室的无菌状态，以便下次使用。

图2 transwell检测细胞迁移的结果图，右边为定量分析图[2]

4. 注意事项

合理控制细胞数量是取得实验成功的关键，正式实验前可先做预实验，摸索适当的密度，不然可能会影响结果的准确性。

在取出Transwell孔板进行观察前，先用PBS冲洗，以去除未贴附或悬浮的细胞，洗完后应立即固定染色，防止细胞过于干燥，染色时间也不能太长或太短。

小室需确认放平于孔板中且细胞悬液要混匀，建议滴加，整个实验过程中小室勿倾斜晃动，以防止细胞铺不均匀。

滴加细胞悬液的过程中要注意防止气泡产生。

Transwell孔板的孔径选择：8 μm规格适配实体瘤细胞的跨膜运动分析，而3 μm微孔系统则专用于淋巴细胞亚群的定向趋化行为检测。

5. 参考资料

[1] Justus C R, Marie M A, Sanderlin E J, Yang L V. Transwell In Vitro Cell Migration and Invasion Assays [J]. Methods in molecular biology (Clifton, NJ), 2023, 2644: 349-359.

[2] Hu R, Cao Y, Wang Y, Zhao T, Yang K, Fan M, Guan M, Hou Y, Ying J, Ma X, Deng N, Sun X, Zhang Y, Zhang X. TMEM120B strengthens breast cancer cell stemness and accelerates chemotherapy resistance via β1-integrin/FAK-TAZ-mTOR signaling axis by binding to MYH9 [J]. Breast cancer research : BCR, 2024, 26(1): 48.