反相色谱是迄今在高效液相色谱中应用最广泛的技术，主要是因为它适用于分析绝大多数的非极性物质和很多的可离子化的及离子化合物。
Q：反相色谱包括哪些？
除C18、C8、C4、C2、C1、CN、NH2和Phenyl等常见的一些键合硅胶固定相外，还有几个分支品种，如混合相固定相（例如苯基－己基）、封尾和未封尾的填料种类以及极性嵌入固定相等。还有其它很多填料也用于反相色谱，包括聚合物、聚合物包覆硅胶和聚合物包覆氧化铝、无机－有机杂化物、涂覆氧化锆和石墨化碳等。不同的固定相分别都有自己的优点和缺点。
当柱子被污染，它的色谱行为和没被污染的柱子会有些不同。被污染的反相色谱柱会产生反压问题，必须进行清洗和再生才能恢复到原来或接近原来的状态。
本文将提出了一些切实可行的恢复方案供大家讨论或参考。着重点在最常用的键合硅胶柱上，其它类型的反相柱的清洁和再生步骤最后也有介绍。
1、污染物在反相柱上的聚集如何观察？
通常，样品基体中会含有一些对分析者来说不感兴趣的东西，如盐、脂类、含脂物质、腐殖酸、疏水蛋白质和其它一些生物质，是一些可能与HPLC柱发生相互作用的物质。
这些物质和目标分析物比，保留能力有些强，有些弱。那些保留能力小的杂质，如盐类，通常在死体积处就会被洗脱出来，在谱图上表现为干扰峰、小斑点、基线扰动、甚至是倒峰等等。
而样品基体中的强保留物质，如果流动相的洗脱能力从来没有调高到足以把它们洗脱出来，多次上样后，它们就会在柱头累积。这种现象通常在等度洗脱时容易观察到。
保留能力中等的杂质能被缓慢洗出而且表现为 宽峰、基线扰动或者基线漂移。
有时，这些被吸附的杂质累积到杂质本身足以作为一种新固定相的程度。分析物能与这些杂质作用，起一定的分离作用。此时保留时间会发生漂移，并出现峰形拖尾。
如果污染程度再严重下去，柱子的反压能超过泵所能承受的最大压力，依照发生堵塞的位置不同，可使柱子无法工作或使柱头塌陷产生空洞。
2、硅胶基质键合反相柱的清洗
再生被污染HPLC柱子的关键是知道污染物的性质并且能找到适当的溶剂来去除。
如果污染是因为重复进样时强保留物质的累积引起的，利用简单的清洗步骤来除去这些污染物往往就能恢复其色谱性能。经过等度运行后的色谱柱，有时用90～100％含量的溶剂B（双溶剂反相系统中洗脱能力较强的溶剂，如甲醇、乙晴、四氢 呋喃等）冲洗20个柱体积可以清除污染物（色谱柱的柱体积和空柱管体积概念不同，一根4.6x250mm柱子的柱体积只有2.5ml，2.1x150mm的是0.28ml）。
如果使用的是缓冲盐系统，不要直接切换到强溶剂，突然转换到高浓度有机溶剂可能会使HPLC流动体系中的缓冲盐沉淀，这样会导致更大的问题，如柱头筛板堵塞、连接管路堵塞、泵泄漏、活塞损伤或进样阀转轴失灵。应该先用无缓冲盐流动相（即把缓冲液换成水），冲洗5～10个柱体积以后才切换到用强溶剂清洗。
有时候，强溶剂B也没法把残留在色谱柱上的污染物洗掉。那么就需要用更强的溶剂或者是系列溶剂组合。
如果污染物不是生物质的，一种强溶剂或几种溶剂组合清洗基本能解决问题。柱子生产厂家的网页和产品说明书上很多也有清洗方法推荐。
所有的清洗方法的模式普遍都类似，溶剂系列中所用溶剂的强度逐级增加，最后一个溶剂往往是非极性（疏水性）很强的（如醋酸乙酯甚至是烷烃），以便于溶解脂质、油类等非极性污染物。溶剂系列中每个溶剂都保证能与下一个溶剂互溶。
整个清洗过程结束后，在回到原来的流动相体系前，必须借助一个中等强度的互溶性非常好的溶剂过渡。例如， 异丙醇是一个非常好的过渡溶剂，它既能与正己烷或二氯甲烷互溶又能与水相溶剂互溶。但是异丙醇粘度非常大，必须确保较低的流速以免使泵压过高。
典型清洗方法
对于典型的硅胶基质键合反相柱，在未使用缓冲溶液的条件下，推荐使用以下清洗溶剂系列：
100％甲醇---100％乙晴---75％乙晴/25％异丙醇---100％异丙醇---100％二氯甲烷---100％正己烷；
每种溶剂冲洗至少10个柱体积，对于250mm×4.6mm的分析柱，合适的冲洗流速是1～2ml/min。最后用10柱体积的异丙醇过渡，然后回到原来的流动相体系（但不含缓冲盐），最后回复到起始流动相配置。
如果使用紫外检测器，须避免选用在紫外区域有吸收的溶剂，要不然需使用大量的溶剂冲洗才能使基线平稳。
四氢呋喃也是另外一种常用的清洗溶剂。
如果怀疑柱子被严重污染，还可用二甲亚砜（DMSO）或 二甲基甲酰铵和水按50：50的比例混合，以低于0.5ml/min的流速冲洗色谱柱。
成功再生反相柱子是一个非常耗时的过程，溶剂冲洗序列可以编成一个梯度洗脱的程序自动进行，以方便过夜操作。
3、清洗硅胶反相柱上的蛋白质残留
如果是生物物质如血浆或血清等积累在反相色谱柱上，必须采用稍不同的清洗方法。
大部分情况下，纯有机溶剂如乙腈或甲醇不能溶解多肽和蛋白质,就不能有效地清洗柱子。不过由有机溶剂和缓冲液、酸,有时还加上离子对试剂等组成的混合液能有用。开始可尝试用高比例的的强溶剂（溶剂B）冲洗。
Freiser和他的合作者发现:用三氟乙酸水溶液和三氟乙酸/丙醇溶液重复进行梯度洗脱,可以再生被污染的反相柱子。
Bhadwaj和Day认为在250mm×46mm的柱子中注入100μL的三氟乙醇就能起到效果。
如果上述几个方法都不成功，Cunico和他的同事推荐了几种强溶剂或增溶剂可用来除去蛋白质，见下所列：
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清洗溶剂 |
组成 |
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醋酸 |
1%水溶液 |
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三氟醋酸 |
1%水溶液 |
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0.1%三氟醋酸水溶液/丙醇 |
40:60(v/v)(较粘,需降低流速) |
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TEA(三乙胺)/丙醇 |
40:60(v/v)(混合前用0.25N磷酸和三乙胺调pH到2.5) |
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脲或胍的水溶液 |
5-8M(调pH到6-8) |
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氯化钠、磷酸钠或硫酸钠溶液 |
0.5-1.0M（磷酸钠pH7.0 |
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DMSO/水 或二甲基甲酰胺/水 |
50：50（v/v） |
在使用这些清洗溶剂之前，可以先咨询柱子的厂商确保这些溶剂不会对填料带来损坏。硅胶基质的柱子通常来说都是可以的，但某些洗涤溶剂的配方可能会使有机聚合物基质的填料膨胀或收缩，从而影响其色谱性能。
另外，须确保上表用的清洗溶剂能与先前用过的溶剂互溶，丙醇可以作为很好的过渡。对每个溶剂系统至少要冲洗20个柱体积。由于有些溶剂系统黏度很大，冲洗的流速应该相应调整以确保不会超过泵压。用完胍或脲等溶剂清洗柱子后，至少应该用40～50柱体积的HPLC级纯水来冲洗。
对于反相柱子，不建议用表面活性剂如十二烷基磺酸钠（SDS）和Trition，因为这些化合物必然会牢固吸附在硅胶键合相柱子上，很难除去。用表面活性剂会影响改变填料表面性质。然而，Separation Group的研究表明:多肽合成产生的保护基和清除剂对柱子的污染，可以通过在流动相中加入500μL 1％SDS溶液以1ml/min的流速清洗掉。然后再用从5％～95％乙腈/1％（v/v）三氟醋酸的梯度洗脱，在起始条件平衡后，就可以恢复柱子的多肽分离功能。
4、清洗反相柱的特殊技巧
4.1去除金属离子吸附
有时用有机溶剂清洗污染柱子并不能成功，尤其是有金属离子吸附在硅胶或键合相上时：
可用鳌合剂如0.05M乙二胺四乙酸（EDTA）冲洗色谱柱，EDTA能与许多金属离子络合并溶解它们。
用完EDTA溶液后，一定要用水充分冲洗柱子。
如果样品中含离子化合物，改变pH可以使它们转为非离子状态，这样就可以被水/有机溶剂洗脱下来。例如，强碱性杂质能在pH低于3时被除去，在这个条件下质子铵变得水溶性更好。酸性杂质能在pH调整到大于其pKa时被洗下来--大约时pH8或9，此时酸性杂质处于离子状态。然而，要注意硅胶柱子在长时间处于高pH条件下容易被破坏。
4.2避免柱子长菌
要避免缓冲液或用缓冲液保存的柱子长菌，可以用普通家用漂白剂1：10或1：20稀释后来冲洗，50柱体积冲洗后，接着至少要用50柱体积色谱纯的水冲洗。
不能让漂白水通过检测器，因为漂白水会腐蚀检测池。
避免溶剂瓶中缓冲液长菌，每次只取足够的缓冲液用，把没用的保存在冰箱里，添加0.1％叠氮化钠在缓冲液中，不能让不流动的缓冲液在柱子中长期存在。
4.3关于使用离子对试剂
色谱工作者经常会讨论到离子对色谱中离子对试剂对固定相的影响。显然离子对试剂如辛烷－磺酸（用于阳离子）和四烷基铵溴（用于阴离子）在一定浓度的有机修饰剂下能很强地吸附在硅胶键合柱子上，柱子因此被污染且很难回复到起始状态。
因此，一般认为用过离子对试剂的柱子都应该专用，而不能再当常规的反相色谱柱用。
Bidlingmeyer不同意这种观点，他认为：离子对色谱所用的pH酸度或碱度很大，在酸性条件下（pH1-3）使键合相和封尾试剂水解，在高pH条件下（pH7-8）溶解硅胶基质，因而使一些柱子的性能改变。要清除磺酸离子对试剂，他建议首先用原先的流动相（仅少了离子对试剂）至少冲洗20柱体积，然后用无缓冲液的流动相冲洗(在这个清洗步骤中，甲醇可能比乙晴更有效；如果是长链的离子对试剂，则用四氢呋喃)。很明显，磺酸离子对试剂和铵离子对试剂有着不同的表现。
Bidlingmeyer和他的合作者证明了：在C18柱子上用甲醇比例超过70%的流动相，长链离子对试剂，如SDS不会吸附在固定相上。这个发现跟Separation Group的结果一致。
4.4整体柱的清洗方法
硅胶键合整体柱如Chromolith 柱子（德国默克公司产品），清洗时可跟别的硅胶柱一样处理。
5、聚合物柱子的再生
用来分离生物分子的聚合柱也会被污染，也需要清洁。
聚合材料非常之好的化学稳定性通常是这种柱子的强处所在。很多厂家建议用1.0M的硝酸或1.0M的氢氧化钠来清洗聚合物柱。一些反相聚合柱，如用聚苯乙烯/二乙烯基苯（PS－DVB）微球作填料的柱子，和用CIM RP－SDVB片做的聚合物整体柱，以及Swift柱子（美国Isco公司），都能耐宽的pH范围（通常pH11～13或有时pH0～14）。
使用者用强有机溶剂冲洗柱子时要注意聚合物材料的溶胀和收缩问题，其程度一般由其交联度决定。高于8～10％交联度的聚合物通常有较好的机械性能，在水溶液中收缩很少，在有机溶剂中膨胀也不大。用一系列溶剂清洗聚合柱之前，最好能阅读使用说明书或咨询生产商的技术支持部门。
PS-DVB柱再生办法
用含0.1％三氟乙酸的2-丙醇以一半流速冲洗10个柱体积以上
用100％流动相B溶剂以一半流速冲洗5个柱体积以上
用100％流动相A溶剂在正常流速下至少平衡10个体积以上
清洗含丁基和乙基的丙烯酸甲酯为基质的整体柱，可按顺序分别反向冲洗10个柱体积的1.0M氢氧化钠、水、20％乙醇溶液和工作缓冲液来清除沉淀的蛋白质。
如果有疏水性更强的蛋白质存在，就应该在水清洗之后插入一个30％异丙醇或70％乙醇的清洗步骤。
如果要清洗或灭活微生物菌落，PS－DVB聚合整体柱可以用0.5～1.0M的氢氧化钠彻底清洗，在室温下至少要用氢氧化钠洗泡一个小时。
用传统聚合基质装填的柱子，用来分离一些溶解度很小的蛋白质如膜蛋白、结构蛋白、和病毒外壳蛋白等，需要用较强的清洗条件。例如含3M盐酸胍的50％异丙醇溶液在60℃才能把这些蛋白质除去。
在固相树脂中去除合成肽，能产生有反应活性的有机正离子，可被苯甲醚和苯硫基甲烷清除。
清除正离子反应产生了大的芳香族分子，这些芳香族分子会在肽纯化时污染柱子。这种污染物在C18柱子上有非常高的保留没法被100％的甲醇或乙晴洗出。要清洗这类柱子，必须把柱子反向冲洗，依次用5柱体积100％异丙醇，3-5个柱体积二氯甲烷，然后再用3-5柱体积异丙醇，最后到初始溶剂系统。可以通过260nm紫外检测到有芳香族杂质的洗脱出。
6、氧化锆基质HPLC柱子的再生
ZirChrom Separations，Inc.（Anoka，Minnesota，USA）生产了一系列的氧化锆基质柱子。该产品系列有几种反相柱子，包括聚丁乙烯，聚苯乙烯和石墨化碳等。
氧化锆比硅胶柱子的pH耐受性要好，所以涂上氧化锆能够耐受更苛刻的条件如高pH和高的操作温度。然而，因为其特殊表面性质，需要维持一定的实验条件才能用这种柱子成功分析各种分析物。
羧酸，氟化物和磷酸根离子都在氧化锆柱子上有强吸附。要清除这些物质，应该用20％乙晴－0.1M氢氧化钠或0.1M四甲基氢氧化铵混合物冲洗50个柱体积，然后用10柱体积的水、50柱体积20％乙晴－0.1M硝酸混合物、10柱体积水，最后是用20柱体积100％有机溶剂，依次冲洗。
对于聚丁乙烯和聚苯乙烯柱子，可以用甲醇、乙晴、异丙醇或四氢呋喃清洗。
而石墨化碳柱子至少要用20％四氢呋喃的溶剂。
结语
含有强保留物质（特别是分子量大或疏水性强的物质、诸如蛋白质一类的生物质成分，以及容易吸附在硅胶表面硅醇基上的强碱性物质等）的样品，通过进样不断进入反相色谱柱，会导致色谱柱污染。另外，某些流动相添加剂，如离子对试剂和表面活性剂，能吸附在填料表面而改变表面性质。被污染的柱子会导致峰形差，保留行为重复性差，高柱压，和基线漂移等现象。通常，用有机溶剂或者是能够破坏污染物与键合相或硅胶表面作用的试剂都能够清洁色谱柱。
色谱工作者在清洗色谱柱时要十分小心谨慎，因为有些试剂腐蚀性活性很强，可能会对键合相本身有损害作用。此外，利用SPE等样品制备技术对样品进行预先净化，可以尽量减少柱子与污染物的接触从而避免柱子的污染。还有使用预柱和保护柱也是避免对分析柱污染和损害的很好方法。
