多肽类药物安全性评价是缺少特定指导原则的。ICH M3（R2）更多是针对小分子，ICH S6（R1）则适用于大分子。多肽药物分子量介于两者之间，制备方式既有化学合成，也有发酵所得。选择1998-2019年间FDA批准的46个多肽药物进行分析，其中21个是化学合成的、6个半合成、18个重组表达、1个是天然产品。其中，5个BLA上市，41个NDA上市。本文就多肽类药物一般毒理研究、遗传毒性研究、免疫原性测定、生殖和发育毒性、杂质、安全药理测定、非蛋白原性氨基酸等相关内容进行简单总结分享。
多肽药物从20世纪初就开始用于临床，早期主要是从天然产物中提取，包括激素替代物胰岛素、促肾上腺皮质激素、抗菌药杆菌肽、多粘菌素B等。20世纪70年代开始，合成的激素类药物开始出现，包括去氨加压素、性腺激素等。随着技术的发展，目前重组表达技术逐渐成为主流，包括甲状旁腺激素和胰高血糖素、杜拉鲁肽、胰岛素类似物等。已经有超过100种肽类药物上市。
多肽类药物是如何定义的呢？关于这点，其实是有一定争议的。通常，多肽药物氨基酸数量在3-100之间。一些非核糖体肽来源的分子，比如棘白菌素抗真菌药卡泊芬净、米卡芬净，脂糖肽类抗菌药万古霉素、达巴万星、特拉万星，以及其它天然产物衍生的非核糖体肽药物环保菌素、博来霉素等，FDA认为属于小分子类别。而用重组DNA技术表达的分子量更大的线性肽，如胰岛素类似物、甲状旁腺激素、人胰岛素生长因子、重组水蛭素等，虽然很多情况是由FDA CDER部门审评（生物药通常由CBER审评），但通常被视为生物药。2020年3月，FDA对肽类药物进行了分类，对于重组表达的超过40个氨基酸的分子被视为生物药物，按照BLA管理。对于小于40个氨基酸的分子（无论通过何种途径制备），或者通过化学合成制备的小于100个氨基酸多肽，被视为新分子实体，按照NDA途径申请。比如已经上市的GLP-1受体激动剂， Fc融合的度拉糖肽和白蛋白融合的阿必鲁肽氨基酸数量远超40个，按照BLA路径申报。艾塞那肽39个氨基酸组成，化合学成所得，按照NDA路径申报。
多肽药物在小分子和大分子之间的游走、不确定性，为这类药物的非临床评价带来很多挑战，是遵循化药的指南还是生物药的法规呢？所属类别不同，种属选择逻辑、免疫原性评估等方面均会有区别。
一般毒理
虽然ICH M3（R2）提及多肽药物不在该指南范围内，ICH S6（R1）则将化学合成或重组表达的多肽纳入指导范围，但实际情况是，几乎所有多肽类药物均参照了ICH M3（R2）开展啮齿类和非啮齿类毒理研究。不过，FDA综述资料里面并未提及如何选择的种属，从结果看，89%（41/46）啮齿类种属选择的大鼠，非啮齿类则比较均衡，46%（21/46）采用的犬，54%（25/46）选择的食蟹猴。多肽类药物的种属选择应该参照生物药思路更多一些。
74%啮齿类研究最长给药周期持续超过6个月（C图），74%非啮齿类研究最长给药周期持续超过9个月（D图）。当然，这是最长给药周期，通常用于支持产品NDA/BLA，支持IND一般不需要开展如此长周期的研究，可根据临床试验方案和推进进度，分阶段开展。另外，大部分肽类药物适用于慢性病如糖尿病等治疗，用药周期长，超过3个月，所以最长给药周期基本是指导原则要求的上限。
生殖和发育毒性
几乎所有多肽药物均开展了Ⅰ段啮齿类生育力研究、Ⅱ段啮齿类或家兔胚胎-胎仔发育毒性研究和Ⅲ段啮齿类出生前、出生后发育毒性研究。具体比例参见下图。
含非蛋白质氨基酸的多肽
非蛋白质氨基酸（Non-Proteogenic Amino Acids, NPAA）是相对于组成蛋白质的20种常见氨基酸而言，指除组成蛋白质的20种常见氨基酸以外的含有氨基和羧基的化合物。有时为改善靶点亲和力或稳定性，会考虑引入非蛋白质氨基酸。NPAA既可以是天然氨基酸也可以是非天然氨基酸。21/47（45%）多肽类药物含有至少1个NPAAs，平均3.5个NPAAs。那么含有NPAAs的肽类药物需要额外开展毒理研究吗？大多数药物未被要求开展额外研究，哪怕使用的NPAA非常新，从未在多肽类药物中使用过。40多个多肽药物中，只有2例药物被FDA要求开展额外毒理研究，bivaluridine和icatibant。原因是这两个药物原液的杂质中均含有2个NPAAs，额外开展了重复给药毒性或细菌回复突变试验。
免疫原性测定
67%（21/46）的肽类药物进行了ADA检测，其中19/21开展了临床前和临床的ADA检测。比较有意思的是凡是临床前ADA阳性的药物，临床的ADA检测结果也是阳性的。反之则不成立，临床前阴性的，临床既有阳性也有阴性。ADA的产生与分子大小相关，产生ADA的肽类药物氨基酸数量为8-84个。不过，90%的肽类药物产生的ADA对药物的PK和药效没有影响。还有一个现象，76% ADA阳性的药物并未进行中和抗体检测。以上描述性统计结果可以看出，通常小分子不做ADA检测，生物药基本都会做，肽类药物介于二者之间，三分之二的药物开展了ADA检测。其实很多小肽免疫原性很低，即使添加佐剂，想获得抗药抗体都不太容易，所以肽类药物因免疫原性影响成药的风险较传统生物药低很多。但如果多肽分子量比较大，比如有几十个氨基酸，或者很多多肽药物做了长效化修饰，比如融合了人Fc、PEG等，或者不同靶点的多肽进行了融合，ADA的风险提高，评估起来就需要更加谨慎。
杂质研究
关于杂质问题，更多还是来自化药评价的思路。57%（16/28）的经化学合成、半合成的多肽药物被FDA要求开展单独的杂质毒理研究，包括体外遗传毒性或一般毒理研究。但关于多肽药物杂质问题，其实没有很明确的说法，能参考的指南还是ICH Q3A和ICH Q3B。
生物转化和PK研究
对于合成、半合成多肽，基本都开展了详细的生物转化研究，包括体外代谢、代谢物结构表征、代谢物体内表征等，类似化药的思路。
遗传毒性研究
通常生物药是不需要开展遗传毒性研究的。对于化药，细菌回复突变、染色体畸变及体内微核的遗传毒性组合试验是需要开展的。肽类药物虽然介于二者之间，但85%（39/46）的药物开展了遗传毒性相关试验。39个肽类药物的组成是：100%化学合成多肽（21/21）、61%（11/18）重组肽、100%（6/6）半合成肽、1个天然肽。不难看出，对于全合成、半合成肽、天然肽，通常需要开展遗传毒性研究，重组表达肽则要视情况而定，不是必须的。而且，全合成、半合成肽、天然肽开展的是完整的遗传毒性标准组合试验，11个开展遗传毒研究的重组肽中，仅7个开展了完整标准组合试验，剩余4个仅选择性开展了其中部分试验。39个多肽中仅2个出现阳性，而且是细菌回复突变阳性，染色体畸变阴性。这2个细菌回复突变阳性的多肽，glucagon和etelcalcetide，前者之后被证明是假阳性，后者经进一步体内外遗传学研究后，也判定为遗传毒性阴性。所以，39个开展遗传毒性研究的多肽，结果都是阴性的。
安全药理学
按照ICH S7B，49%（20/41）多肽药物开展了体外钾离子通道安全药理研究—hERG试验。大多数多肽药物开展了单独的大鼠和/或犬的心血管和呼吸系统安全药理学研究，个别采用非人灵长类进行的研究。
致癌试验
50%（23/46）的多肽药物开展了致癌性研究。其中，16/23开展了两个啮齿类种属的致癌试验，7/23仅开展了1个啮齿类种属的研究。不开展致癌试验的原因包括：1）临床给药周期短；2）肿瘤适应症；3）ADA的影响；4）有些作用机制产品已明确致癌风险，企业在说明书中直接注明致癌阳性，如GLP-1激动剂引发的甲状腺C细胞肿瘤。
13/23个开展致癌试验的肽类药物的结果是阳性的，其中7个作用于GLP-1靶点。前文已经提及，所有多肽药物的遗传毒性结果都是阴性的，故致癌阳性基本都是药物药理作用引起的。比如胰岛素具有促有丝分裂的作用，赖谷胰岛素和甘精胰岛素对啮齿类动物具有致癌作用。
总结
对于化药、生物药没有太大区别的试验，比如生殖毒性、安全药理、致癌，无论大分子还是小分子，需不需要开展，考量的因素是类似的。但对于ADA评价、遗传毒性、体外代谢、杂质研究、相关动物种属选择，就需要明确多肽药物的归属，到底是按照M3还是S6。由于缺少特定的针对多肽药物的指南，多数多肽类药物还是按照化药的思路开展非临床安评。没有统一的指南，就很难有统一的行业操作标准，大家也是根据自己的理解、过往产品的研究经验，化药和生物药交叉结合的思路设计非临床试验。已经上市的多肽类药物很多，可以根据自己产品的特点比如靶点、作用机制、适应症等，结合已上市药物的经验，必要时跟监管机构沟通，合理设计非临床研究策略。
