一、 写在前面

Western Blotting（WB）作为常见的蛋白检测手段之一，通常是绝大部分科研工作者不可避免的一项基础实验。然而，其实验流程相对较为复杂，忽视任一细节均有可能导致整个实验的失败，这也常令很多科研者苦不堪言。目的条带不清晰而背景却又黑又脏，甚至显影出来只能看见黑乎乎的背景，这是WB中最为常见的问题之一，是什么原因导致了高背景的出现？面对这种情况我们该如何解决呢？本文就从以下几个方面进行详细地介绍。

二、 常见的背景来源及解决方案

1．样品质量

样品质量是决定WB成败的关键一步，绝大多数情况下我们均是以提取总蛋白作为WB的开端。而在总蛋白提取过程中不可避免会受到诸如核酸、脂类、裂解液等物质的干扰，样品纯度受到影响自然而然会带来高背景。此外，在我们目的蛋白表达量较低的情况下，其在总蛋白中的比例也相应较低，不易检测到，为优化目的条带，不得不做出提高抗体浓度、加大上样量等措施，由此造成高背景。

因此，在提取总蛋白时，一方面我们需要保证尽可能地提高样品纯度，如：吸取蛋白时需小心谨慎，避免吸入杂质；另一方面则要防止蛋白降解造成蛋白丢失，如：提取过程均在低温环境中进行、加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解等。

2．上样量

上样量对背景也有影响。如果预实验发现蛋白浓度较低，那么下次提取时就需要适当提高组织或细胞用量，而不可一味地加大上样量，如下图所示，加大上样量时，背景也会随之加深。

3．封闭

封闭的目的在于去除其他无关蛋白的影响，倘若封闭不完全，就会产生高背景。这通常也是产生高背景时需要优先考虑并进行优化的因素，一方面可以提高封闭液的浓度，另一方面亦可延长封闭时间，以降低背景。

4．洗涤

洗涤不彻底也会导致一些非特异性结合的残留，从而产生高背景。因此，可以通过加大洗涤液的用量、增加洗涤次数、延长洗涤时间来改善。

5．膜

一方面，需要确保我们所采用的NC膜或PVDF膜保存得当，是干净无污的，以免膜本身的原因影响显影造成高背景；另一方面，在整个操作过程中要充分确保膜的湿润，谨防干膜带来高背景。

6．抗体

抗体浓度过高时也会导致高背景，甚至条带反白，因此，需通过预实验摸索抗体浓度及孵育时间，寻求合适的抗体孵育条件。另外，抗体本身的质量也是造成高背景的关键，抗体质量有问题，要么直接无条带，要么产生过多杂带造成高背景，此时就需要考虑换抗体，当然，由于抗体售后过于繁琐，更换抗体也会增加实验成本，耽误实验进度等问题，因此，更换抗体也是我们毫无束手之策时才需要考虑的。

三、 其他实用小Tips

1．洗涤时，无论采用PBST还是TBST，Tween-20均在其中发挥着关键作用，其能有效去除非特异性结合产物，降低背景，可以将其通俗的理解为去污剂，倘若背景较深时，可以适当加大PBST或TBST中Tween-20的用量，以有效去除背景；

2．显影后倘若发现背景较深，可再次进行封闭然后重新孵育抗体；

3．背景较深时，亦可将条带置于洗涤液中放在4℃冰箱保存过夜，浸泡一晚甚至更长时间后再去显影，可以有效降低背景，但需以不影响目的带为宜。