1、pH

大多数细胞系在pH 7.4时生长最好，尽管不同细胞系的最佳pH有差异，但基本上都在pH7.0-7.7之间，高于7.7，低于6.5，细胞就会出现生长抑制。

为了方便实验者能及时关注到pH的变化，培养基会加入酚红这种pH指示剂，pH 7.4时，它呈红色，高于7.7后，变成紫红色，低于7.0时变成橘红色，6.5时就会变成黄色。

一般来说，细胞在培养时，随着细胞增殖，培养基颜色会逐步变黄，但如果在短时间内变黄，则大概率是出问题了，例如污染。

2、 二氧化碳

正因为pH的稳定对细胞生长有很大影响，因此，在细胞培养时，通入特定浓度的二氧化碳、加入具有缓冲能力的平衡盐溶液就很有必要了。大气中的二氧化碳浓度是0.04%，但培养箱中的二氧化碳浓度通常是5%，也有2%-10%的。

目前的研究推断认为，通入二氧化碳，能溶解在培养基中，和水反应形成碳酸，进而分解为氢离子和碳酸氢根离子，这个反应是一个动态平衡的过程，即可向右也可以向左进行。

这个化学反应可以维持细胞在低生长密度时的生长稳定，当细胞生长密度变大至每毫升超过10000个细胞时，其维持效果就基本没有了。

3、 氧气

另一个重要的因素是氧气，由于体外培养的细胞在培养器皿内大多是以单层贴壁生长的，和体内不同，体内的细胞是成三维结构存在的，因此体外培养的细胞能接触氧气的方式更简单高效。

研究也表明，体外培养时，细胞获得能量，主要是靠糖酵解这一个途径，因此其对氧气的需求也是比较低的。所以，体外培养细胞，并不需要额外向培养箱通特定浓度的氧气。我们只需要注意培养器皿内的培养基深度就可以了。

有文献表明，静置培养的细胞，培养基深度最好保持在2-5mm之间，也就是0.2-0.5mL/cm2 的培养基的量，因为这个深度的液体比较有利于维持氧气在细胞中的扩散率。

4、 温度

最后需要提一下的就是温度，推荐的培养温度是37摄氏度，可以比这个低，但尽量不要比它高。

以经常研究的哺乳动物细胞为例，它们即使在4摄氏度环境下，都能存活几天，但如果改成在39.5摄氏度环境下时，几个小时就会挂了。