自从1960s年代双特异性抗体概念提出，到杂交瘤技术、knobs-into-holes技术的发展，TCE已经取得了长足进步，并陆续进入市场，造福肿瘤患者。已经获批的TCE靶点包括CD3/CD20、CD3/BCMA、CD3/CD19、CD3/GPRC5D、CD3/DLL3等。典型的TCE结构是个三聚合物，由TCE、T细胞和肿瘤细胞组成，通过T细胞激活，释放炎症因子和细胞毒性分子，杀伤肿瘤细胞。考虑到TCE的免疫激活特点，首次临床起始剂量（FIH）选择通常基于MABEL（minimal anticipated biological effect level）方法。MABEL方法主要采用的体外药理学活性试验（pharmacological activity assays）终点进行计算。关于体外药理学活性试验如何影响MABEL计算起始剂量，其实是有一些细节需要考虑的，并不是随便选择一个细胞试验的结果就拿来计算起始剂量。TCE免疫激动剂属于高活性产品，起始剂量计算可能失之毫厘差之千里，过低会影响临床进度、成本和患者伦理，过高则会引入安全性风险。

可以从六个变量着手分析：1）靶细胞来源和靶点表达水平；2）效应细胞来源；3）效靶比（E:T ratio）；4）孵育时间；5）试验终点选择；6）ECx.

靶细胞来源和靶点表达水平

理想的靶细胞来源是什么？是原代细胞还是细胞系？还是不同细胞来源的靶细胞均可以？理论上，患者来源的细胞/肿瘤（patient-derived cells/tumors, PDCs）比细胞系（cell lines）在靶点表达水平、肿瘤异质性和T细胞杀伤敏感性方面，与人体的相关性更强。如果采用靶点表达密度与临床不相关的细胞系进行计算，得到的剂量不一定适用于临床目标人群。但是，采用PDCs也有挑战，一是来源问题，不易获取；二是样本间的变异，尤其是实体瘤。细胞系的优势是可获得性、结果的均一性会更好。如果无法获得PDCs，不得不使用细胞系时，需谨慎选择有代表性的细胞，并考量靶点表达水平的生理相关性。

效应细胞来源

应该采用什么样的效应细胞开展TCE的体外活性研究呢？PBMC、全血、纯化的T细胞还是活化的T细胞？通常来讲，患者来源的PBMC含有更丰富的免疫细胞分类，比纯化的或活化的T细胞更合适。全血包括所有的血液成分，如果某些靶点除了膜表达，还有一定比例的可溶性占比，那么采用全血作为效应细胞，能提供更多的信息。这点我的理解是，某些膜靶点如BCMA，也会被酶或者其它方式切掉，产生一部分的游离可溶性靶点，而可溶性靶点也是可以结合TCE的。对于这类靶点，PBMC就不如全血的临床相关性更强一些。当然，采用全血作为效应细胞的方法相较于PBMC，更具挑战和难度。最理想的效应细胞应该是患者来源的效应细胞或患者肿瘤中驻留的T细胞，这类细胞代表了患者体内真正的杀伤细胞，但这类效应细胞的来源、变异面临一些挑战。另外，患者来源的PBMC虽然比健康人的效应功能更弱，但与预期临床活性却更为相关。

关于靶细胞、效应细胞选择对FIH起始剂量选择的影响，有个不错的案例。Teclistamab是一款CD3/BCMA双特异性TCE，采用MM.1R细胞系作为靶细胞，纯化的健康人T细胞作为效应细胞，效靶比为5:1，EC20作为计算依据，获得的FIH起始剂量为0.3μg/kg。这一剂量其实有些过于保守，比teclistamab后续step-up首剂量60μg/kg低了200倍。后续回顾性分析发现，如果采用PDCs作为靶细胞，起始剂量至少可以提高10倍。如果采用患者PBMC作为效应细胞，效果则会更好。毕竟健康人的PBMC本身就可能比患者效应功能更强，更何况是纯化的T细胞。

效靶比（E:T ratio）

确定了靶细胞和效应细胞，接下来的问题便是应该设置什么样的效靶比最为合适。效应细胞：靶细胞的比例越高，比如3:1、5:1、10:1，会影响EC50或EC20值，过高估计待测产品的活性，导致更低的起始剂量。并不是每个适应症对应一个统一的效靶比，毕竟每个患者的免疫状态和靶负荷不同。临床比较常见的一个场景是患者经过标准治疗（以化疗居多）后，免疫细胞大幅降低，之后肿瘤进展，肿瘤负荷增加，形成的局面是效靶比明显降低。另外，对于免疫细胞浸润比较少的冷肿瘤，效靶比也很低。来自Genentech的Michael Z. Liao等人（2020），评估过一款治疗胃癌的TCE产品，10:1和1:5的效靶比相比，获得的FIH起始剂量低10倍。

解决效靶比的其中一个路径是采用患者的肿瘤样本进行效靶比检测，根据真实的效靶比情况设计体外活性试验方案。如果拿不到患者样本，可以查询有没有公开文献报道。

通常来讲，血液瘤的效靶比较实体瘤更高，前者可以考虑1:1，后者则可以考虑1:5或者1:10，预期与临床相关性更好。当然，前提是1:1的效靶比在体外试验中能观察到功能信号，即对设置的终点有响应。如果因效靶比太低，导致剂量-反应关系不明显，可以借助定量系统药理学（QSP）模型辅助进行剂量-反应关系预测。

孵育时间

靶细胞和效应细胞的孵育时间决定了反应是否达到了Emax，即最大效应。时间点设置因TCE分子设计、靶点等而异。孵育时间过久会导致人为误差，过度高估产品活性，影响起始剂量设计。可以通过表征不同时间点的活性，进行动态评估，找到Tmax（time to max effect）。如果采用细胞因子作为体外试验的终点指标，考虑到细胞因子随时间延长，分泌增加，且体内-体外相关性尚不完全清楚。故，通常建议细胞因子的检测，取早期时间点如24h或48h更合适一些。

试验终点选择

TCE常见的体外活性终点包括T细胞激活（CD69+、CD25+）、细胞毒性、细胞因子释放等。哪个终点用于MABEL计算相关性更好？如果T细胞激活或者细胞毒性作为最敏感的终点还好，倒没有太多讲究。唯一需要提醒的是，如果效靶比太低，以细胞毒性作为试验终点，剂量-反应关系的获得可能是个挑战。CD25和CD69的区别是，CD69作为T细胞激活的early marker，用于测定给予起始剂量后的early activity，相关性更好。

如果采用细胞因子作为终点指标，却是有一些注意事项需要考虑。细胞因子是白介素、干扰素、肿瘤坏死因子等一系列小分子蛋白质或多肽的混合物。其中IL-6和其他促炎因子（如IL-1b）与CRS机制最为相关。选择细胞因子作为试验终点的挑战性体现在两点，一是受不同donor个体间的高变异影响，二是细胞因子是一组组合物，单一细胞因子的意义有限，最好能看到关键细胞因子的共同升高，如TNF-α、IFN-γ、GM-CSF、IL-1、IL-6。比如CD3/GPRC5D双抗talquetamab，发现IL-10是最敏感的试验终点，EC20为0.032nM。考虑到其他细胞因子的升高水平不如IL-10那么敏感，且个体间变异很大，最后选择了T细胞激活标志物CD25作为起始剂量计算依据，较IL-10计算的剂量高2.5倍。CD3/CD20双抗odronextamab则不同，本品体外活性观察到TNF-α、IFN-γ、IL-6均升高，且EC50介于0.3-0.5nM，敏感度类似。

ECx

所谓ECx，是指选择EC20、EC30还是EC50作为计算依据。毫无疑问，EC20、EC30获得的剂量会更为安全，同时也意味着比较保守。大部分TCE，采用EC50获得的起始剂量是可以接受的。来自合适的体外药理学试验数据，FDA也同意采用EC50进行MABEL计算。当然，对于全新靶点，且有off-tumor表达，可以考虑采用更保守的EC20、EC30，其他情况可以考虑以EC50进行计算。

案例

下表罗列了4个TCE双抗的MABEL法计算FIH起始剂量的体外药理试验特点。Teclistamab靶细胞除了细胞系，也采用了PDCs，且基于PDCs获得的剂量与step-up剂量更为接近。可能出于安全性考虑，最终选择的更保守的细胞系来源的数据。效应细胞来源方面，健康人血样可获得性更强，用的最多。另外，效靶比偏高，5:1、10:1为主。孵育时间介于24-48h。试验终点细胞毒性、T细胞激活均可。Odronextamab也采用了细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6进行了计算，且能得到更高，相关性更好的起始剂量。不过，很明显，大多数TCE产品选择了更为保守的策略。相信随着TCE研究数据的积累，MABEL计算FIH起始剂量会更科学、更理性。