1. 实验原理

细胞内分泌实验主要用于研究细胞分泌特定分子（如蛋白质、激素等）的能力和机制。

本文以胰岛β细胞为例，探讨其在不同条件下的胰岛素分泌情况。胰岛素是由胰岛β细胞合成并分泌的一种关键激素，调节血糖水平。通过模拟生理或病理状态，可以评估不同因素对胰岛素分泌的影响。

图片来源：https://www.britannica.com/science/islets-of-Langerhans

以胰岛β细胞为例，其胰岛素分泌机制如下：

葡萄糖代谢触发：葡萄糖通过GLUT2转运体进入细胞，经糖酵解和线粒体氧化磷酸化生成ATP。

离子通道调控：ATP/ADP比例升高关闭KATP通道，细胞去极化激活电压依赖性Ca²⁺通道，Ca²⁺内流触发胰岛素囊泡胞吐。

分泌检测：通过ELISA、化学发光法或放射免疫分析（RIA）定量上清液中胰岛素含量。

图片来源：https://doi.org/10.3389/fcell.2017.00055

2. 实验材料

2.1 细胞与试剂

1. 细胞系：INS-1 832/13细胞（大鼠胰岛素瘤细胞，ATCC CRL-11471）或原代小鼠胰岛细胞。

2. 培养基：

基础培养基：RPMI 1640（Gibco, 11875-093）含11.1 mM葡萄糖，补充10% FBS（Gibco, 10099-141）、1 mM丙酮酸钠、50 μM β-巯基乙醇。

Krebs-Ringer缓冲液（KRB）：129 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 2.5 mM CaCl₂, 1.2 mM MgSO₄, 1.2 mM KH₂PO₄, 5 mM NaHCO₃, 10 mM HEPES（pH 7.4），含0.1% BSA。

3. 刺激剂：

高糖KRB：含16.7 mM葡萄糖（Sigma, G8769）。

阳性对照：30 mM KCl（通过去极化直接激活Ca²⁺通道）。

检测试剂：小鼠/大鼠胰岛素ELISA试剂盒（Mercodia, 10-1247-01）。

2.2 仪器与耗材

细胞培养箱（37℃, 5% CO₂）

24孔细胞培养板（Corning, 3524）

低温离心机（4℃, 1000×g）

酶标仪（BioTek, Synergy H1）

3. 实验步骤

3.1 细胞培养与预处理

1. 细胞复苏与传代：

INS-1细胞用含11.1 mM葡萄糖的RPMI 1640培养基培养，每2-3天传代（胰酶消化比例1:3）。

注意：细胞密度维持于70-80%汇合，传代超过30代需更换新批次。

2. 饥饿处理：

实验前夜，更换为低糖培养基（2.8 mM葡萄糖）培养12小时，同步细胞分泌状态。

3.2 胰岛素分泌实验

1. 细胞铺板：

消化细胞，调整密度至2×10⁵ cells/mL，接种于24孔板（500 μL/孔），培养48小时至单层融合。

2. 刺激分泌：

洗涤：用预温KRB缓冲液（2.8 mM葡萄糖）轻柔洗涤细胞3次。

分组处理（每孔加入1 mL KRB）：

阴性对照：2.8 mM葡萄糖。

实验组：16.7 mM葡萄糖。

阳性对照：30 mM KCl（含2.8 mM葡萄糖）。

孵育：37℃、5% CO₂孵育1小时。

3. 样本收集：

吸取上清液，4℃ 1000×g离心5分钟去除细胞碎片，-80℃保存待测。

细胞裂解：加入100 μL RIPA裂解液，BCA法测定总蛋白浓度（用于数据标准化）。

3.3 胰岛素定量（ELISA法）

1. 标准品稀释：按试剂盒说明配制0-200 μIU/mL标准曲线。

2. 检测步骤：

加样：50 μL标准品或样本至预包被板孔，25℃孵育2小时。

洗涤：洗板5次。

加酶标二抗：100 μL/孔，25℃孵育1小时。

显色：加入TMB底物100 μL/孔，避光反应15分钟。

终止：50 μL 1M H₂SO₄，450 nm测吸光度。

3. 计算：

根据标准曲线计算胰岛素浓度（μIU/mL），结果以“分泌量/总蛋白（μIU/mg）”表示。

4. 注意事项与常见问题

4.1 关键操作规范

1. 细胞状态：原代胰岛细胞需在分离后24小时内使用，INS-1细胞传代次数≤30。

2. 缓冲液温度：KRB缓冲液需预温至37℃，避免温度应激影响分泌。

3. 样本处理：上清液离心后立即分装冻存，反复冻融导致胰岛素降解。

4.2 常见问题与解决方案

参考文献：

Rorsman, P. & Ashcroft, F. M. (2018). "Pancreatic β-Cell Electrical Activity and Insulin Secretion: Of Mice and Men". Physiological Reviews.

Mercodia AB (2022). Insulin ELISA Kit Product Manual.

Freshney, R. I. (2016). Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 7th ed. Wiley-Blackwell.

Skelin, M. et al. (2010). "The Regulation of Insulin Secretion in Human Pancreatic Islets". Diabetes.