1. 实验原理

脑立体定位注射是基于三维立体坐标系统（X，Y，Z轴），通过颅骨上的解剖学标志（如前囟、后囟、颅缝等）确定大脑内部目标区域的精确位，将药物、病毒载体或其他物质注入大脑特定区域的技术，目前已广泛应用于神经科学研究和临床治疗。

2. 实验材料

耗材：玻璃微电极、1 mL注射器、棉签

试剂：病毒（通常-80℃液氮冻存，避免反复冻融；比需要注射的体积多300 nL左右）、生理盐水（0.9% NaCl溶液）、3M组织胶

设备：玻璃微电极拉制仪、脑立体定位仪、注射泵和它相应的控制器、加热垫

3. 实验步骤

吸取病毒→固定小鼠→定位调平→钻孔开颅→注射病毒→留针→术后处理

3.1 吸取病毒

用微电极拉制仪上设定好的程序拉制玻璃微管，将玻璃微电极的尖端剪短，并用石蜡油填充满直至溢出；

将它装在注射泵上，控制器控制泵打出少许（200 nL）体积的石蜡油以判别气密性是否完好；

若石蜡油可以打出表示气密性完好，之后用含有生理盐水的注射器清洗玻璃微电极的针尖，然后吸取病毒（速度50-80 nL/min）。

3.2 固定小鼠

将麻醉好的小鼠固定在脑立体定位仪上，先将小鼠前门齿卡入适配器的孔再将上方旋钮拧紧；

用耳杆穿过小鼠的耳朵寻找合适的卡点，注意耳杆的距离等长，也不要用蛮力，不然小鼠会被夹死。

3.3 定位调平

剪开小鼠的头皮，寻找bregma点即冠状缝与矢状缝的交汇点，以及lambda点即人字缝与矢状缝的交汇点，定位两点在同一高度即可（一般不会超过0.05 mm）；

左右调平，判别bregma点之后1.8 mm左右旁开1.5 mm的两个点的高度是否一致（一般不会超过0.05 mm），若不一致，调节左右的升降旋钮进行调节。

3.4 钻孔开颅

调平之后，用玻璃微电极的尖端与bregma点调齐定义零点；

然后调节定位仪定位目标脑区，例如NAc（AP：1.4 mm；mL：±1.2 mm；DV：4.2 mm），用注射器尖端标记一下颅骨上的位置，用无菌骨钻（参考转数10000rpm）缓慢打磨颅骨钻孔（避免电钻钻到脑）。

3.5 注射病毒

玻璃微电极缓慢下降看针尖能否落到钻的小孔中，若能，在针尖接触到脑膜的时候定义深度的零点；

然后缓慢下降（0.02 mm/s）到目标脑区深度（例如NAc，4.2 mm），用注射泵的控制器注射病毒（一般体积在300-500 nL，速度一般在30-50 nL/min）。

3.6 留针

待病毒注射完后，静置5-10 min即可出针；

清理颅骨上的杂质，缝合头皮，在缝合处点上组织胶（利于小鼠恢复），之后取下小鼠将其放在加热垫上等待其苏醒。

3.7 术后处理

显微镜下检查缝合情况；

脑部组织回位：轻柔按压周围组织消除气隙；

苏醒监测：记录恢复时间（正常范围5-15 min）。

4. 注意事项

玻璃微电极尖端的长度注意控制，太长吸取病毒或打出病毒的时候容易堵塞，太短的话无法伸到目标脑区；

注射病毒前观察病毒是否能打出来，避免耽误时间；

注射病毒的时候注意观察病毒是否从脑沿针尖溢出。

5. 参考资料

[1] Dudek KA, Paton SEJ, Binder LB, et al. Astrocytic cannabinoid receptor 1 promotes resilience by dampening stress-induced blood-brain barrier alterations. Nat Neurosci.

[2] Zhou K, Xu H, Lu S, et al. Reward and aversion processing by input-defined parallel nucleus accumbens circuits in mice. Nat Commun. 2022;13(1):6244.