植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定BJS 201707

　　1 范围

　　本方法规定了食品核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分鉴定的实时荧光PCR方法。

　　本方法适用于核桃露（乳）、杏仁露、果仁露等复合植物蛋白饮料中标识含有核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分的检测及鉴定。

 

　　2 原理

　　提取试样中基因组DNA，以DNA为模板，利用物种特异性引物及探针进行实时荧光PCR扩增检测，同时设置阳性、阴性及空白对照。根据扩增的Ct值，判定试样中是否含有该源性成分。

 

　　3试剂和材料

　　除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB 6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

 

　　3.1核桃源性成分Jugr2基因检测用引物对序列为：

　　核桃5’端引物：5’-CGCGCAGAGAAAGCAGAG-3’

　　核桃3’端引物：5’-GACTCATGTCTCGACCTAATGCT-3’

　　核桃探针：5’-FAM-TTGTGCCTCTGTTGCTCCTCTTCCC-TAMRA-3’

 

　　3.2花生源性成分Ara b2基因检测用引物（对）序列为：

　　花生5’端引物：5’-GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG-3’

　　花生3’端引物：5’-CGCTGTGGTGCCCTAAGG-3’

　　花生探针：5’-FAM-AGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG-Eclipse-3’

 

　　3.3 杏仁源性成分Prudul基因检测用引物（对）序列为：

　　杏仁5’端引物：5’-TTTGGTTGAAGGAGATGCTC-3’

　　杏仁3’端引物：5’-TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG-3’

　　杏仁探针：5’-FAM-TCCATCAGCAGATGCCACCAAC- Eclipse-3’

 

　　3.4芝麻源性成分2S albumim mRNA基因检测用引物（对）序列为：

　　芝麻5’端引物：5’-CCAGAGGGCTAGGGACCTTC-3’

　　芝麻3’端引物：5’-CTCGGAATTGGCATTGCTG-3’

　　芝麻探针：5’-FAM-TCGCAGGTGCAACATGCGACC- TAMRA-3’

 

　　3.5榛子源性成分oleosin基因检测用引物（对）序列为：

　　榛子5’端引物：5’-CCCCGCTGTTTGTGATAT-3’

　　榛子3’端引物：5’-ATGATAATAAGCGATACTGTGAT-3’

　　榛子探针：5’-FAM-TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT- Eclipse-3’

 

　　3.6大豆源性成分Lectin基因检测用引物（对）序列为：

　　大豆5’端引物：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’

　　大豆3’端引物：5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’

　　大豆探针：5’-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC- TAMRA-3’

 

　　3.7真核生物18SrRNA内参照检测用引物（对）序列为：

　　内参照5’端引物： 5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’

　　内参照3’端引物： 5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’

　　内参照探针：5’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC- TAMRA-3’

 

　　3.8 CTAB缓冲液：55 mmol/L CTAB，1400mmol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris，

　　用10%盐酸调节pH 至8.0，121℃高压灭菌20 min, 备用。

 

　　3.9 蛋白酶K：20mg/mL。

 

　　3.10苯酚：氯仿：异戊醇（体积比：25:24:1）。

 

　　3.11 异丙醇。

 

　　3.12 70%乙醇。

 

　　3.13 Taq DNA聚合酶。

 

　　3.14 dNTP混合液。

 

　　3.15 TE缓冲液（Tris-HCl、EDTA缓冲液）：10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。

 

　　3.16 10×PCR缓冲液：200 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，200 mmol/L Tris-HCl（pH8.8）。

 

　　4仪器和设备

 

　　4.1 组织研磨器。

 

　　4.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

 

　　4.3 恒温水浴锅。

 

　　4.4 离心机：离心力12,000g。

 

　　4.5 微量移液器（0.5μL~10μL，10μL~100μL，10μL~200μL，100μL~1000μL）。

 

　　4.6 实时荧光PCR仪。

 

　　4.7 涡旋振荡器。

 

　　4.8 天平：感量0.01g。

 

　　5分析步骤

 

　　5.1 试样总DNA的提取

　　固体样品：将样品粉碎后称取0.3~0.6 g，按下列方法提取DNA。也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA。

　　液体样品：取1 mL 样品于Eppordorf管中，加入1 倍体积的异丙醇，混合均匀，室温下沉淀5 min，室温下以12,500 rpm 离心5 min，弃去上清液。重复此操作一次。所得的沉淀用于提取DNA。可按下列方法提取DNA，也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA。

　　（1）将处理后的样品加入2 mL离心管中，加入600 μL CTAB缓冲液和40 μL蛋白酶K溶液，振荡混匀，65℃孵育1 h（过夜孵育更好）， 期间每隔10 min振荡混匀；

　　（2）加入500 μL的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），振荡抽提10 min，室温下以12,500 rpm 离心10 min；

　　（3）小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇，振荡均匀，12,500 rpm 离心10 min；

　　（4）弃去上清液，用65℃预热的TE缓冲液溶解DNA；

　　（5）小心吸取上清，加入200 μL氯仿：异戊醇（24:1），振荡抽提，室温下以12500 rpm 离心15 min；

　　（6）小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇，振荡均匀，12,500rpm 离心10 min；

　　（7）弃去上清液，沉淀用70% 乙醇洗涤，离心1min，晾干，溶于50μLTE 缓冲液中。

 

　　5.2 DNA浓度和纯度的测定

　　取1μL DNA溶液，使用核酸蛋白分析仪检测其浓度及质量，OD260/280值应在1.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增。

 

　　5.3 实时荧光PCR扩增

　　反应体系总体积为25μL，其中10×PCR缓冲液5μL，正反向引物（10μmol/L）各1μL，探针（10μmol/L）1μL，dNTPs（10μmol/L）2μL ，Taq DNA聚合酶（2.5U）0.2 μL，DNA模板（10-100ng/μL）2μL，用灭菌去离子水补足至总体积25μL。真核生物内参照的反应体系同上，仅替换相应的引物和探针。也可使用相应的商品化扩增试剂盒。

　　反应参数：50℃ 2min； 95℃ 15min； 95℃ 15s， 60℃ 1min， 40个循环。

 

　　5.4 实验对照

　　检验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以相应植物源物种提取的DNA为阳性对照，以已知不含该植物源的物种DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照。样品、内参照和对照设置两个平行的反应体系。

 

　　6结果判断与表述

 

　　6.1 质量控制

　　以下条件有一条不满足时，结果视为无效：

　　（a）空白对照：无FAM荧光信号检出；

　　（b）阴性对照：无FAM荧光信号检出；

　　（c）阳性对照：有FAM荧光信号检出，且FAM通道出现典型的扩增曲线，Ct值≤35.0；

　　（d）内参对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0。

 

　　6.2 结果判定

　　（a）如Ct值≤35.0，则判定为被检样品阳性；

　　（b）如Ct值≥40.0，则判定为被检样品阴性；

　　（c）如35.0＜Ct值＜40.0，则重复试验一次。如再次扩增后Ct值仍为35.0＜Ct值＜40.0，则判定被检样品可疑。

 

　　6.3 结果表述

　　结果为阳性者，结合产品标识，表述为“检出XX源性成分”。

　　结果为阴性者，结合产品标识，表述为“未检出XX源性成分”。

　　结果为可疑者，结合产品标识，表述为“XX源性成分可疑”。

 

　　7防污染措施

　　检测过程中放置交叉污染的措施按照GB/T 27403中的规定执行。