1. 实验概述

细胞共培养技术常常被用于探究细胞间相互作用、疾病模型构建、药物研发等方面，例如细胞共培养体系能够模拟体内复杂的细胞微环境，通过显微镜可以直观观察不同类型细胞在共培养时的行为变化，如细胞迁移、黏附、分化等，深入了解细胞间的信号传导机制。下面介绍用显微镜观察细胞共培养时常见的问题和一些经验分享。

2. 经验分享

2.1 实验操作

2.1.1 细胞接种与培养

细胞比例

根据实验目的和细胞特性确定合适的共培养细胞比例。比如在研究肿瘤细胞与免疫细胞相互作用时，可能需要按照不同的比例将肿瘤细胞和免疫细胞进行接种，一般可先从1:1、1:2、2:1等比例尝试，通过预实验确定最佳比例。

接种密度

要保证细胞在培养过程中有足够的生长空间和营养物质，同时避免细胞过于稀疏或密集影响观察效果。例如对于大多数细胞，12孔板的接种密度应为：5×104~105/cm2个细胞。

培养条件优化

不同细胞对培养条件要求不同，需摸索出适合共培养细胞的最佳培养条件。如一些细胞需要5% CO₂，而另一些可能需要更高或更低的浓度；培养温度一般为37℃，但有些特殊细胞可能需要微调。

2.1.2 显微镜选择与使用

显微镜类型

根据观察需求选择合适的显微镜。相差显微镜适合观察活细胞的形态和结构；荧光显微镜（徕卡Leica）可用于观察细胞内特定荧光标记的蛋白、核酸等；共聚焦显微镜（ZEISS蔡司）则能实现对细胞的三维成像，更清晰地观察细胞内部结构和细胞间的相互作用。

参数设置

调整合适的光照强度、对比度、焦距等参数。对于较厚的细胞共培养样本，可适当降低光照强度，避免过度曝光；通过调整对比度使细胞结构更清晰；使用微调旋钮精确聚焦，以获得清晰的细胞图像。

图像采集

选择合适的相机和采集软件，设置合适的采集参数，如分辨率、曝光时间等。一般来说，高分辨率的图像有助于观察细胞的细节，但文件大小也会相应增加。曝光时间要根据细胞的荧光强度或对比度进行调整，避免图像过亮或过暗。

2.2常见问题解析

2.2.1细胞生长状态不佳

原因：可能是培养基成分不合适、血清质量差、培养条件不满足细胞需求或细胞本身状态不佳等。

解决方法：更换合适的培养基和血清，严格控制培养条件，如温度、CO₂浓度等；对细胞进行复苏、传代等操作时，要确保操作规范，避免细胞受到损伤。

2.2.2 细胞混杂或污染

原因：细胞接种过程中操作不规范，如未严格遵守无菌操作原则，导致细菌、真菌或其他细胞污染；或者细胞株本身不纯。

解决方法：接种细胞时要在超净工作台内进行，严格消毒双手和实验器材；定期对细胞进行支原体等检测，一旦发现污染，及时丢弃受污染的细胞，重新复苏或购买新的细胞株。

2.2.3 观察到的细胞形态异常

原因：可能是细胞受到外界因素刺激，如药物处理、培养环境改变等；也可能是细胞处于不同的生长阶段或发生了病变。

解决方法：分析细胞形态异常是否与实验处理有关，若与药物处理有关，可调整药物浓度或处理时间；同时，与正常细胞形态进行对比，判断细胞是否发生病变或分化。例如BV2细胞、RAW264.7细胞等在正常状态下均呈现较小的细胞体，呈圆形或椭圆形，若受到外界环境的刺激例如细菌或真菌污染，均可长出触角。

2.2.4 荧光信号弱或背景高

原因：荧光标记物的浓度过低、荧光淬灭、细胞固定或透化处理不当、抗体非特异性结合等都可能导致荧光信号弱或背景高。

荧光淬灭，信号弱，背景高

荧光强度过高，续需调低曝光度

解决方法：优化荧光标记物的浓度，避免荧光标记物长时间暴露在光下导致淬灭；严格按照细胞固定和透化的操作步骤进行处理；选择特异性高的抗体，并进行预实验确定最佳抗体浓度。