您当前的位置：检测资讯 > 法规标准
嘉峪检测网 2019-03-06 16:00
叶绿素（Chlorophyll）是植物光合作用中的重要光合色素，可分为a、b、c、d四类。叶绿素不溶于水，而溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等；叶绿素不很稳定，光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解；叶绿素a分子式为C55H72O5N4Mg，酸性条件下，叶绿素a分子很容易失去卟啉环中的镁成为脱镁叶绿素；叶绿素a存在于所有的浮游植物中，大约占有机干重的1%～2%。
叶绿素a本身对环境没有危害，但它是估算浮游植物生物量的重要指标，可以通过测定水中浮游植物叶绿素a的含量，掌握水体的初级生产力情况和富营养化水平，在环境监测中，叶绿素a含量是评价水体富营养化的指标之一。
国外相关分析方法研究
ASTMD3731-87(2012)标准方法采用90%丙酮为提取试剂，玻璃纤维滤膜过滤水样，研磨后4℃浸泡提取浮游植物的叶绿素。测定叶绿素的主要步骤如下:
（1）过滤：
抽滤前加入碳酸镁悬浊液防止色素分解。负压不能超过50kPa。
（2）叶绿素的提取：
先研磨，将滤膜放置于组织研磨器中，加入4-5ml 的90%丙酮溶液，500r/min 研磨3min。破碎滤膜上浮游植物藻类细胞。
然后浸泡提取：将破碎后的细胞提取液转移至15ml 离心管中，用90%丙酮溶液冲洗研磨器及研磨杵一并转入离心管，定容至10ml。混匀后4℃暗处浸泡提取。浸泡时间为15min 至24h。过程中要颠倒混匀数次。
最后离心澄清：1000g 离心20min 或过滤，将上清液转移至旋塞玻璃小瓶中。
（3）测定方法：
分光光度法，三色方程测定664nm、647nm、630nm、750nm 吸光度计算叶绿素a、b、c 叶绿素含量。单色方程测定脱镁叶绿素a 校正后的含量。
EPA446.0 采用90%丙酮为提取试剂，玻璃纤维滤膜过滤水样，研磨后4℃浸泡提取藻类的叶绿素。主要测定步骤如下:
（1）抽滤：
采用玻璃纤维滤膜。将玻璃纤维滤膜放置在连接有真空泵的抽滤器上，负压不超过20Kpa。轻轻搅拌或颠倒混匀样品，准确量取一定体积的水样，缓慢减压，水样完全通过滤膜时结束抽滤。用镊子将滤膜取出，带有样品一面向内对折，用滤纸吸干剩余水分。如不及时提取，应将滤膜放入培养皿中，外面包裹一层铝箔，样品滤膜-20℃暗处冷冻保存。
（2）研磨：
将滤膜剪成小块放入组织研磨器管底，用大肚移液管加4ml 丙酮（90%），电动研磨500 转/分提取1 分钟，注意保持避光及低温。将悬浊液转移至15ml 带旋帽的离心管中，再用6ml 丙酮冲洗研磨棒及玻璃管转移至离心管中。定容至10ml。时间5min。然后冷暗处保存。用清水及丙酮清洗研磨器后再处理下一个样品。最后做一个空白膜。
（3）低温浸泡：
然后用力震荡离心管，4℃浸泡2～24 小时，期间至少震荡2 到3 次。充分提取。
（4）离心：
浸泡后提取后，675g 离心15 分钟。
（5）测定方法：
分光光度法，于750、664、647、630nm 处测定吸光度值，三色方程计算叶绿素a、b、c1＋c2；单色方程测定脱镁叶绿素校正的含量。90%丙酮调零，弱光中倾倒或用移液管将离心上清液转移至玻璃比色皿中，750nm 吸光度值应＜0.005AU，否则应再次离心或通过玻璃纤维针式滤器。
标准的前处理操作同446.0，用荧光计进行测定。
标准的前处理操作同446.0，提取液离心后，过0.45μm针式滤器过滤，取50~200μl样品进入高效液相色谱进行分析，检测波长为440nm。
《ISO 10260-1992》、《英国标准协会BS ISO 10260：1992（2014）》、《日本JIS K0400-80-10：2000》。采用热乙醇分光光度法测定叶绿素。主要步骤如下：
（1）提取方法：
可采用热乙醇水浴法，准确量取20～25ml 乙醇（90%），浸泡滤膜，拧紧聚四氟乙烯帽的玻璃小瓶旋塞。轻微震荡悬浮滤膜。将玻璃瓶放入75℃水浴锅中，液面与样品一致。水浴5min，轻微震荡。取出室温冷却15min。滤膜过滤或者离心，取上清液分光光度测定。也可采用热乙醇研磨法：加入75℃热乙醇30～50ml。用棒式研磨器研磨3min。过玻璃纤维滤膜，转移至100ml（或50）容量瓶中，定容。
（2）测定方法：
将前处理后的上清液转移至比色皿中，并留有足够体积用于酸化待测。90%乙醇调零，测定665nm及750nm 吸光度值。注意：665nm 吸光度值0.01～0.8 之间，所以应合适选择过滤水样体积、提取剂体积、比色皿量程。建议开始时选择0.5L 水样。用HCL（3mol/L）酸化提取液，用量每10mL 加0.01ml。震荡，5～30min 后在665nm 处测定吸光度。国外相关标准分析方法见表3。
比较国外测定叶绿素的方法可知，EPA 447.0 高效液相色谱法能够很精确的测定各种光合色素的含量，但是仪器昂贵，分析操作步骤繁琐，EPA 445.0 荧光光度计也能够精确的测定叶绿素a 的含量，特别是能够测定叶绿素含量较低的样品，但是分析过程中容易受其他色素或色素衍生物的干扰，因此这两种方法难以作为常规的监测方法，而分光光度法由于操作简单，成为最常用的叶绿素a 的测定方法。
国内相关分析方法研究
（1）抽滤：
在抽滤器上装好乙酸纤维滤膜，倒入定量体积的水样进行抽滤，抽滤时负压不能超过50kPa。
（2）研磨：
水样过滤后，取出带有浮游植物的滤膜，在冰箱内低温干燥6～8h后放入组织研磨器中，加入少量碳酸镁粉末及2～3ml90%丙酮，充分研磨，提取叶绿素a。
（3）离心：
用离心机（3000～4000r/min）离心10min。将上清液倒入5ml或10ml容量瓶中。再用2～3ml的90%丙酮，继续研磨提取，离心10min。
（4）测定：
将上清液再转入容量瓶中，重复1～2次，用90%的丙酮定容为5ml或10ml，摇匀。1cm比色皿，90%丙酮为参比溶液，750、663、645、630nm处测定吸光度值。
水利行业标准测定叶绿素的具体操作步骤如下：
（1）抽滤：
将玻璃纤维滤膜放置在连接有真空泵的抽滤器上，根据水样中叶绿素的浓度准确量取一定体积的混匀水样进行抽滤，负压不超过20kPa，逐渐减压，在水样刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，用镊子小心将滤膜取出，将有样品一面对折，用滤纸吸干剩余水分。如果样品不能及时提取，应将吸干水分的滤膜放入培养皿中，外面包裹一层铝箔，放入﹣20℃冰箱中保存。
（2）提取：
将过滤后的滤膜放入具塞玻璃离心管中，盖紧塞帽。放入﹣40℃低温冰箱中冷冻20min，取出放置于室温下5min，此过程反复三次。向玻璃离心管中加入10ml 90%丙酮溶液，盖紧塞帽剧烈摇振片刻，放置于4℃冰箱中，避光浸泡4～12h 备用，在浸泡过程中，应摇动2～3 次。
（3）离心：
将离心管放入离心机，以3500r/min 的速度离心15min。
（4）测定：
将离心后的上清液倒入1cm 比色皿中，以90%丙酮做参比，分别在750、664、647、630nm 波长处测定吸光度值。
（1） 过滤：
在过滤装置上装 还玻璃纤维滤膜，根据水体的营养状态确定取样体积，用量量筒量取一定量的混匀样品，进行过滤，最后用少量蒸馏水冲洗虑器壁。
（2） 研磨：
将滤膜剪碎，放入研钵或匀浆器中，加入6~8ml90%丙酮，在500~1000r/min转速下研磨1~3min，滤膜完全磨成糊状后，将匀浆器中的样品倒入离心管中，再用少许90%丙酮冲洗匀浆器2~3次，倒入离心管中，盖上管塞，摇动后置于黑暗低温处（冰箱）静置，提取时间不少于8小时和不多于20小时。
（3） 离心：
将离心管放入离心机中，在3000~4000r/min转速下离心10~15分钟，将上清液移入具刻度离心管，再加少量90%丙酮于原抽提用的离心管中，再次悬浮沉淀物并离心，再将上清液合并，此操作应重复1~2次，直至沉淀物不含色素为止，最后将提取后的上清液定容到10ml。
（4） 测定：
测定665nm和750nm处的吸光度，用0.1N盐酸酸化后再测定750和665 nm处的吸光度，代入公式计算叶绿素a和脱镁叶绿素a的浓度。
将一定量水样用玻璃纤维滤膜过滤，以90%丙酮为提取液研磨提取水中浮游植物的叶绿素，离心后测定其750nm、664nm、647nm、630nm 波长下的吸光度值，计算叶绿素a 的含量。
测定叶绿素的具体操作步骤如下：
（1） 过滤：
在过滤装置上装 还玻璃纤维滤膜，根据水体的营养状态确定取样体积，用量量筒量取一定量的混匀样品，进行过滤，最后用少量蒸馏水冲洗虑器壁。
（2） 研磨：
将样品滤膜放置于研磨装置中，加入 3~4mL丙酮溶液，研磨至糊状。补加3~4mL丙酮溶液，继续研磨，并重复1~2次，保证充分研磨5min以上。将完全破碎后的细胞提取液转移至玻璃刻度离心管中，用丙酮溶液冲洗研钵及研磨杵，一并转移入离心管中，定容至10Ml。
（3） 浸泡提取：
将离心管中的研磨提取液充分震荡混匀后，用铝箔包好，放置于4摄氏度下避光浸泡提取2小时以上。
（4） 离心：
将离心管放入离心机，以3000~4000r/min的速度离心10min，然后用针式滤器过滤上清液得到叶绿素a的丙酮提取液待测。
（5） 空白试样的配置：
用实验用水按照与试样的制备相同的步骤进行实验室空白试样的制备。
（6） 测定：
将试样转移至比色皿中，以丙酮溶液为参比溶液，于波长750nm、664nm、647nm、630nm处测吸光度。
国内外方法中的各种实验条件总结如下：
（1）提取试剂：
除热乙醇方法，国内外标准方法均采用90%丙酮作为提取试剂。EPA446.0 指出，90%丙酮溶液可以有效提取大部分藻类细胞中的叶绿素a，而且不产生其它衍生物。丙酮是国际上较为公认的提取叶绿素的试剂。
（2）滤膜：
除《水和废水监测分析方法（第四版）》采用乙酸纤维滤膜外，均采用玻璃纤维滤膜。
（3）样品保存方法：
样品的保存条件各种方法略有不同，但水样采集后均保证4℃冷藏保存，样品滤膜可冷冻保存。而且叶绿素a 测定样品滤膜冷冻后再研磨，可提高提取效率。如采样后不立刻测定，-18℃下冰冻，再于室温条件下融解，利用细胞内冰粒的形成和细胞液浓度的增高引起溶涨，使胞壁结构破碎引起叶绿素溶出。
（4）是否研磨及研磨后是否需要浸泡：
目前国内也有很多文献报道了对上述叶绿素a提取方法的改进研究，如延长提取时间。水利部行业标准《叶绿素a的测定分光光度法》（SL88-2012）叶绿素测定的主要操作是低温反复冷冻提取-避光冷藏浸泡-离心，在EPA的446.0的基础上改进了提取方法。考虑到不同地区仪器设备的能力差异，-40℃的超低温冰箱不是所有的环境监测部门均具备的仪器设备，所以将样品滤膜的冷冻作为辅助的提取条件。
（5）计算公式及波长：
关于计算方法，主要有三色法和单色法，三色法主要考虑了叶绿素b 和叶绿素c 对测定的干扰，测定的是表观叶绿素a 的含量（包括叶绿素a 与脱镁叶绿素a 之和），单色法考虑脱镁叶绿素a 的干扰.从方法的简便性来说，三色法操作简单，产生误差几率小，耗时比单色法短。
来源：实验与分析
