糖类不仅是生命体的基本组成部分和重要营养物质，还参与众多生物体的生命活动，糖分析是研究其在生命体转化和生理作用的前提和重要手段。由于单糖是构成多糖的基本单元，多糖分析一般通过多糖Smith降解得单糖､二糖等低聚糖，定量分析降解产物来确定多糖的组成，然后通过其他手段确定糖连接方式和空间结构，因此单糖和二糖的定量分析是多糖分析的基础。单糖和二糖还是制药工业的基本营养补充剂和药物辅料，也是食品工业的重要添加剂。因此，准确测定单糖和二糖的含量不仅是保证食品､药品安全的需要，也是多糖分析的基础｡

 

单糖和二糖为多羟基醛､酮及其衍生物，极性大，缺乏光学吸收基团，使用常规的紫外分光光度法(UV)､高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)､高效毛细管电泳-紫外法(HPCE-UV)和气相色谱法(GC)直接分析受到很大限制｡长期以来，单糖和二糖分析一直具有挑战性，成为制约整个糖类研究领域发展的瓶颈。随着色谱技术的发展，单糖和二糖的定量分析技术取得了长足进步，分析工作者发展了单糖和二糖的定量分析方法，下面我们就来深入了解各种分析方法的特点及应用，并重点介绍几种最有前途的方法，以期给糖类分析提供启发和借鉴。

 

经典分析方法

 

经典分析方法包括重量法、滴定法、旋光法和比色法。由于方法缺乏专属性，仅用于糖单质或总糖量的定量分析。

 

重量法和滴定法的原理都是利用糖的还原性，使糖与氧化性试剂发生氧化还原反应。

 

重量法中糖与碱性铜试剂反应，生成红色的氧化亚铜沉淀，滤取沉淀称重，由门生一华克葡萄糖换算表查出试样相当于葡萄糖的含量。由于该法需称定沉淀的质量，操作繁琐且易产生误差，现基本不再使用。

 

滴定法有亚碘酸钠滴定法、硫酸铈滴定法、斐林试剂热滴定法、SHS碱性铜试剂滴定法等，目前中国药典（一部）中含葡萄糖的注射液采用滴定法测定葡萄糖含量，由于方法不具备分离功能，只能用于还原糖的单质或总还原糖的定量分析。

 

旋光法是利用糖的旋光性测定糖单质的含量，目前糖单质测定使用较多，如葡萄糖注射液和果糖的测定采用旋光法。该法不需要大型仪器，快速、简便。

 

传统比色法包括苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和地衣酚法。其中前两种方法用于测定己糖，后一种方法用于戊糖的测定。比色法的原理是通过化学反应使单糖形成有色物质后测其吸收度，用葡萄糖绘制标准曲线，测得样品吸光度后查标准曲线得总糖量。方法同样不具备专属性，无法确定样品的具体组成。

 

近红外光谱法和拉曼光谱法

 

近红外光谱法（NIR）和拉曼光谱法均为无损检测技术，可用于样品快速分析和原位在线分析，特别适用于含糖食品、药品的快速分析和生产控制。

 

两种方法分析步骤基本一致，包括：

 

① 收集样品，分校正集和预测集两组；

 

② 采集校正集图谱，经图谱预处理、化学计量学方法提取数据、建立预测模型；

 

③ 录制预测集数据并验证模型；

 

④ 样品分析。

 

但这两种方法均需使用大量批次的样品借助化学计量学法建立和验证模型，而且检测准确度受建模所用样品的数量、品质影响较大。

 

薄层扫描法

 

薄层扫描法（TLCS）分离效能高，消耗低，测定复杂样品时不存在色谱堵塞的问题，但方法在精密度和准确度方面较其他色谱法差，故应用较少。

 

气相色谱和气相色谱-质谱联用法

 

由于单糖和二糖极性大、不易气化，使用气相色谱法测定时，需要化学衍生增加被测组分的挥发性，衍生方法有硅烷化和乙酰化。

 

气相色谱-质谱法（GC-MS）不仅能定量分析，仪器自带的谱库对定性分析也有很大的优势。

 

GC特别是GC-MS常用于多糖组成分析，但衍生反应不仅耗时长，衍生化的复杂操作也影响了准确度。

 

液相色谱法

 

液相色谱法能满足绝大多数糖类测定要求，是应用最广、使用最多的色谱测糖技术，按使用的检测器不同，分为紫外检测器（UV）（包括二极管阵列检测器，DAD）和通用检测器两类。通用检测器有示差折光检测器（RID）、蒸发光散射检测器（ELSD）、质谱检测器（MS）和电化学检测器等。

 

高效液相色谱-示差检测法（HPLC-RID）为许多标准使用的单糖和二糖检测方法，如《食品安全国家标准蜂蜜》和中国药典均采用HPLC-RID测定蜂蜜中的单糖和二糖，中国药典中许多单糖也采用该法测定。但RID使用梯度洗脱时会发生极限漂移，影响定量的准确度。

 

ELSD是HPLC检测不含生色团物质的常用检测器，但基线平衡时间长、不能使用含盐流动相。

 

质谱检测器可用于结构解析，具备同时定性、定性的优势，但LC-MS目前没有谱库，需人工解析定性，不如GC-MS使用方便。

 

由于单糖和二糖不具备生色团，只在低波长区有吸收，信号受干扰大，使用高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）时，常需要化学衍生使糖链带上生色团以满足光学检测要求。产生紫外发色团的衍生方法有还原氨基化法、3-(4-羧基苯甲酰基)-2-喹啉甲醛法，1-对甲氧基苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮法（PMP）等，其中PMP由于具有衍生条件温和、不产生立体异构体、不损失唾液酸等优点最为常用。

 

HPLC分析无生色团物质的另一种方法是采用荧光衍生化，常用的荧光衍生试剂有对氨基苯甲酸和2-(12-苯唑[b]吖啶-5(12H)-yl)-乙酰肼（BAAH）两种。

 

化学衍生法虽然可提高方法的灵敏度，但衍生反应操作复杂、耗时长，衍生反应完全程度受试验条件影响，定量结果重现性差。

 

离子色谱法

 

离子色谱法（IC）是近二十年来发展起来的离子和极性物质分析法，常用检测器是电导检测器，其他检测器还有安培、紫外、原子吸收、原子发射、质谱和蒸发光散射检测器等。安培检测器适用于解离度低、具有氧化还原性物质的检测，由于糖类多具有还原性，常采用脉冲安培检测器（PAD）。分析单糖、二糖时，样品稀释后直接进样，组分在色谱柱上经过离子交换和疏水等作用实现分离，通过脉冲安培检测器检测。

 

按载体材料不同，IC的色谱柱分为有机聚合物载体填充柱和无机载体填充柱两种，前者既可以用于阳离子又可用于阴离子分析，填充剂在较宽的酸度（pH0~14）内具有较高的稳定性，后者一般适用于阳离子分析，硅胶载体填充剂只在pH2~8的洗脱液中稳定。按载体上键合的交换功能基团不同，IC的色谱柱分为阴离子交换柱和阳离子交换柱，糖类分析一般使用以有机聚合物为载体的阴离子交换柱，常见的有戴安CarboPacPA系列和瑞士万通的Metrosep Carb系列。

 

文献报道的糖类测定多采用高效阴离子交换-脉冲安培检测法(HPAE-PAD)，且多采用梯度洗脱。

 

HPAE-PAD测定糖时无需衍生，可直接进样测定，样品处理方法简单，分离效能好，可同时测定多种糖及其糖醛酸，灵敏度可媲美衍生-HPLC-UV，仪器价格适中，淋洗液主要是氢氧化钠等无机试剂的水溶液，不像HPLC消耗有机溶剂，试验消耗低、环境友好，但理想的电极材料较少，有时存在信号稳定性差的问题。

 

毛细管电泳法

 

衍生化-毛细管区带电泳紫外检测法

 

毛细管电泳法（HPCE）分离效能高，可同时分离多达十几种糖，特别适用复杂多糖水解样品的分析。

 

HPCE检测器有UV检测器、激光诱导荧光检测器、电化学检测器、MS检测器等，糖检测多使用UV检测器，但由于缺少吸收基团，检测前常需进行化学衍生。

 

HPCE分离机制有毛细管区带电泳（CZE）、毛细管等速电泳、胶束电动毛细管色谱等，糖分析以CZE为主。

 

常规的HPCE测糖方法是进样前对糖进行化学衍生，采用CZE模式分离，以UV检测器检测，即衍生化-毛细管区带电泳紫外检测法（衍生法化-HPCE-UV）。

 

与HPLC-UV类似，衍生化-HPCE-UV衍生操作耗时、技术要求高、加上HPCE进样不够精确，结果重现性较差。

 

非衍生-毛细管区带电泳中紫外直接检测法

 

ROVIO等采用非衍生-毛细管区带电泳中紫外直接检测法，以弹性石英毛细管柱为分离柱，130mmol/L的NaOH+30mmol/L的Na2HPO4溶液(pH12.6)为运行缓冲溶液，测定波长为270nm，不经衍生化直接测定了纸浆､果汁和白兰地中的中性糖的含量，通过方法优化，在40min内一次最多同时测定12种糖，其中单糖10种，二糖2种，灵敏度与衍生化-HPCE-UV相近，方法显示了糖测定方面的诱人前景。

 

这种方法颠覆了单糖､二糖在中紫外区无吸收的共识，ROVIO等给出的解释是紫外吸收来自糖醛基或糖酮基烯醇化后在碱性条件下产生的醇盐，但这种观点无法解释大多数二糖在270nm处的吸收原因，因为许多二糖缺少羰基而不能发生烯醇化。

 

SARAZIN等通过对ROVIO等方法的进一步的研究，对单糖､二糖在中紫外区吸收机理做了另外的解释，认为糖在检测窗口起了光化学降解反应，产生了烯醇化丙二醛盐中间体，这可能是糖在270nm附近产生紫外吸收的原因，并通过巧妙的试验设计证明光化学反应被200nm以下的紫外光激发，而且通过试验进一步证实中间体存在时间非常短暂。SARAZIN等给出的葡萄糖降解反应见下图：

葡萄糖光化学降解途径

 

之后还有报道显示，非衍生-HPCE-CZE-UV在分离度､回收率､信号强度､适用性等方面均优于HPLC。

 

ROVIO等还对影响糖分离的各种条件，如毛细管长度，分离程序，运行缓冲溶液的浓度､酸度进行了深入研究，并考察了组成缓冲溶液电解质的作用。该团队的扎实工作和SARAZIN等的出色理论解释为单糖和二糖的定量分析提供了一种全新的途径。

 

展  望

 

多糖组成的多样性决定了其分析方法需要采用色谱法，而单糖和二糖难挥发和无生色团的特点又限制了多数色谱法的直接使用，HPAE-PAD和非衍生-HPCE-UV无需复杂的化学衍生直接测定，克服了经典色谱法测定单糖和二糖的缺点，显示了广阔的应用前景。

 

容量法、旋光法和比色法

 

经典测糖法中，容量法除用于总还原糖测定外，还可用于旋光性药物的葡萄糖溶液测定；旋光法可用于糖单质测定。这两种方法由于仪器价廉、操作简便，在食品药品质量控制领域仍有较大实用价值。

 

比色法不具备分离功能，用于多糖水解物测定时，只能粗略测定总糖量，对多糖分析意义不大，且操作比容量法、旋光法复杂，随着色谱技术的发展和仪器普及，使用会越来越少。

 

衍生化的GC、HPLC、HPCE

 

衍生化的GC､HPLC､HPCE尽管目前仍为糖分析的研究热点，除非能克服衍生反应耗时长､操作复杂和不易重现的缺点，否则会逐渐被其他色谱法取代。

 

HPLC-RID、HPLC-ELSD和TLCS

 

HPLC-RID尽管在药典和食品标准方法中广泛使用，但由于限制使用梯度洗脱和平衡时间长的缺点，会逐步被其他方法取代。HPLC-ELSD由于近年来仪器的普及，会在相当长时间内作为糖类定量分析的主流方法，但其对含盐流动相使用的限制和基线平衡时间长的缺点会影响其在糖分析中的长期应用。TLCS低准确度的缺点会继续阻碍其广泛应用。

 

LC-MS和GC-MS

 

LC-MS和GC-MS尽管仪器昂贵且测糖时多数情况下需要衍生化样品，但二者兼有定性、定量功能使其在多糖分析中有不可替代的优势，会继续在多糖分析中发挥作用。

 

NIR和拉曼光谱法

 

随着便携式仪器的发展，在食品药品质量监控领域的糖快速分析方面，二者会发挥越来越重要的作用，随着光纤技术的成熟，NIR和拉曼光谱法作为无损检测技术，对实现单糖和二糖工业生产的在线控制方面有着美好前景。

 

HPAE-PAD和非衍生-HPCE-UV

 

HPAE-PAD灵敏度高，淋洗液环境友好､价廉，仪器价格适中，是最有前途的单糖和二糖定量分析方法之一，随着电极材料和色谱柱的多样化及仪器的普及，在单糖和二糖测定中应用必将越来越多。

 

非衍生-HPCE-CZE-UV既有分离效能高､分离模式多样，适合复杂样品分离的优势，又有无需对糖衍生，样品处理简单､测定快速､试验消耗低等优点，采用内标法定量可显著提高定量准确度，满足准确分析要求，是糖分析最有竞争力的手段，随着仪器普及和研究深入，可以预见，该方法将为复杂糖类化合物的一级结构分析提供强大的支撑。