前一段时间，小编有幸参加了仿制药峰会，其中在一个小组讨论会上，很多实验猿们问到同一个问题：

 

“溶出方法验证中，除了标准介质以外，其他几个介质也需要同样的方法验证吗？”

 

对此，大家都表示这点上，中美意见不一。

在美国，只需要做标准介质中的方法学验证。

但是在国内，每个溶出曲线所用介质中的方法学验证都需要做。

 

巨大的工作量呀，一堆分析青年已哭晕在地！

身为无能为力，只能完成的一份子。小编只能说，该做还得做。

这时候我们提高工作效率的方法就只剩一条路，就是思路清晰，安排合理，减少出错。

 

今天小编就分享一下，对于溶出方法学的验证，有哪些工作需要做呢？

溶出度方法验证基本包括如下几项

（1）专属性

（2）准确度

（3）精密度

（4）线性和范围

（5）耐用性

 

相信下面这个表格，大家再熟悉不过了吧，身为分析工作人员，见它的次数甚至多余自己的同学和好友。

接下来我们就详细讨论一下我们的溶出方法学到底该怎么做。     

 

溶出度的适用范围

1.溶解度在微溶以下的药物；

2.溶解度虽在略溶以上，但处方与工艺造成阻溶的制剂；

3.治疗剂量与中毒剂量接近的制剂；

4.缓释制剂、控释制剂、肠溶制剂等；

5.易溶于水或极易溶于水的药物，也要考察溶出度。

这条不多说，不在范围内的大家估计也不会做~~~~

 

溶出介质的选择

溶出介质除了参考各国药典外，还要根据自制样品的处方工艺，选择具有区分力的介质。

 

溶出曲线一般要考察至少3种介质，对于仿制药，在标准介质中的溶出曲线必做。

溶出介质第一次配制时，要测定pH值，与标准值的差值应不超过0.1（对于pH依赖性药物，差值应不超过0.05）。溶出介质使用前要加热、超声或真空脱气。

 

常用溶出介质：

pH1.0~2.2，溶出介质：盐酸溶液

pH3.8~4.0，溶出介质：醋酸盐酸缓冲液

pH4.5~5.8，溶出介质：醋酸盐或磷酸盐缓冲液

pH6.8~8.0，溶出介质：磷酸盐缓冲液

溶出介质体积的选择

漏槽条件

溶出介质的量至少是药物全部溶解时用量的3倍以上，即满足漏槽条件。

漏槽条件指药物溶解度的3~7倍体积，是做溶出的最佳条件，一般情况下我们选择溶出介质的体积为500ml、900ml和1000ml。

在制剂的溶出曲线测定过程中溶剂的体积超过此漏槽条件，可视样品在溶剂中的溶出过程不受溶剂体积的影响。

 

如何测定待测样品溶解度？

测定步骤：

（1）将待测样品所用原料置于各介质中（如标准介质、0.1mol/L盐酸介质、pH4.5醋酸缓冲液，pH6.8磷酸盐缓冲液、水等），配制成饱和溶液。

（2）将饱和溶液放置在振荡器中，设定温度为37±0.5℃、转速200rpm，振荡满24小时。

（3）将溶液取出，进行适当稀释，测定溶液中原料的含量，计算溶解度。

 

如果选择900ml介质不能满足漏槽条件的情况下考虑添加一定量的表面活性剂，如SDS，吐温；从最小添加比例开始筛选，0.05%，0.1%······0.5%。

 

如果仍不能满足溶出要求，考虑原料处理，如微粉化行不行，辅料选择优化；或者做成包合物，固体分散体新剂型。

 

该项实验需在样品小试过程中需要完成的，对处方的优化也有一定指导作用。

 

溶出方法及转速的选择

 

中国药典中测定方法包括第一法（转篮法）、第二法（浆法）、第三法（小杯法）。其中小杯法的适用范围小。

 

转篮法——75rpm/100rpm，以100rpm为主。适用范围有胶囊剂、丸剂、片剂、或是一些漂浮的制剂。

 

桨法——50rpm/75rpm，以50rpm为主。适用范围有片剂、胶囊剂和丸剂。

一般认为桨法50rpm相当于转篮法100rpm

 

如：参照中国药典2015版二部厄贝沙坦分散片溶出度项下条件采用的溶出方法及转速：桨法（中国药典2015版四部-通则0931第二法）、转速为每分钟50转。

 

2015版药典四部-通则0931第二法

 

检测波长的选择

 

将对照液在200nm~400nm进行紫外扫描，一般选择最大吸收波长，但需排除辅料或溶出介质的干扰。

 

如：采用紫外-可见分光光度法测定，取厄贝沙坦对照品20mg，置100ml量瓶中，加溶出介质0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml置100ml量瓶中，加溶出介质稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，以0.1mol/L盐酸溶液为空白在200～400nm波长范围内扫描。

另取辅料、自制制剂、参比制剂同法用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含厄贝沙坦10μg的溶液，在200～400nm波长范围内扫描。

专属性

首先要明确，在溶出方法学验证中，所用的溶媒是溶出介质。

专属性目的是考察辅料和胶囊壳对溶出度测定是否有干扰。

 

HPLC法判断标准：

满足以下条件说明该方法的专属性符合要求。

（1）空白溶液、空白辅料，对主要成分无干扰，在主成分的位置不出峰；

（2）供试品溶液色谱峰的理论板数、拖尾因子要符合要求；

（3）对照品溶液和供试品溶液的峰面积相差不超过10%。也就是说对照品溶液和供试液的浓度不要相差太大，因为不同的稀释倍数，稀释过程中所用的试剂、玻璃容器、溶出介质、都有可能造成专属性的误差。

 

UV法专属性试验方法及判断标准：

干扰溶液配置：

（1）空白溶剂

（2）空白辅料溶液

（3）胶囊剂应配置空胶囊壳溶出液（严格按照样品溶出度测定的步骤，取6粒空白胶囊壳进行试验。尽可能完全的除尽胶囊内容物）。

取这3种溶液适量，做紫外检测，记录吸光度，根据对照品溶液结果，测定干扰值。

 

干扰试验标准：

干扰值在2%以下可忽略不计，2~5%之间可适当将限度提高（如厄贝沙坦胶囊溶出度限度为标示量的80%，但是干扰试验为4%，可将限度相应提高为85%），超过5%则测定方法不可用。

 

如果是胶囊产生的干扰试验，应进行囊壳的消除试验。首先空胶囊仅对UV测定有干扰，药典规定如干扰不大于标示量的2% ，可忽略不计；干扰大于标示量的2%，可更换波长或者再换一种其他胶囊壳，减少测定干扰。

胶囊壳的批次、来源不用、紫外吸收强度也各不相同，故干扰也常常不同。若胶囊壳的干扰较大时，建议采用HPLC法进行测定。

 

线性和范围

 

取对照品适量，按标准方法配制一系列浓度的溶液，通常不少于6份，例如20%、40%、60%、80%、100%（标准浓度）、120%。

线性的最低点最好包含溶出曲线第一点的溶出值。

 

如：厄贝沙坦在以0.1mol/L盐酸溶液900ml为溶出介质，转速为每分钟50转，依法操作，分别于5min、10min、15min、20min、30min、45min时，取溶出液测定吸光度，计算得5min时溶出度为13.6%，则标准曲线的范围可以设定为10%、25%、50%、75%、100%（标准浓度）、150%。

 

设计标准浓度时请注意以下两点。

（1）HPLC法：最低浓度样品的色谱图中，信噪比不低于10:1。

（2）UV法：最佳吸光度在0.3~0.7之间，根据具体样品也可以0.2~0.8之间。

 

以峰面积（吸光度值）对浓度进行线性回归，线性相关系数r不小于0.9990。

y轴截距的绝对值不超过100%浓度样品峰面积的2%。

 

 

精密度实验

 

仪器精密度

取对照品溶液，连续进样6针/连续测定6次紫外吸光度值。

规定：HPLC峰面积/紫外吸光度值的RSD不超过2.0%，保留时间RSD不超过1.0%。

 

 

重复性

取待测样品1片/粒，置溶出杯中，按照溶出度方法进行测定，至取样点时取溶出液，分为6份，分别进行溶出度测定，计算RSD。

规定：HPLC峰面积/吸光度的RSD不超过2.0%（n=6）。

 

小编提示：该项试验和重现性试验（批间均一性）并不相同。

重复性实验证明以本方法制备供试品溶液测定时重复性良好。

重现性试验时考察制剂工艺稳定性及溶出度方法重复性的一项重要指标。

 

中间精密度

与重复性同时取样，由不同的实验人员，用不同检测仪器。

规定：测定结果与重复性的结果合并计算，HPLC峰面积/吸光度RSD不超过2.0%（n=12）。

 

 

溶液稳定性试验

 

包括对照品溶液稳定性和供试液稳定性。

 

对照品溶液稳定性：取对照品溶液适量，在室温下放置，分别于0、2、4、6、8、12、24小时、2天、3天、4天、5天测定吸光度值/峰面积值，计算稳定性。

 

供试液稳定性：取自制样品适量，用相应介质制备成供试液，在室温下放置，分别于0、2、4、6、8、12、24小时······测定吸光度或峰面积值，计算稳定性。

 

规定：取每时间点的主峰峰面积/吸光度值，计算其RSD，应不大于2%，则说明该溶液在此时间段内的稳定性良好。

 

稳定性时间的考察以满足自己的实验需求为准。

例如考虑到成本问题，对于稳定性很好的对照品，可以配置成贮备液使用，但是需要考察日间稳定性。

对于UV法测定的供试液，一般稳定性做到24小时即可，缓控释制剂可相对延长时间。

对于HPLC法测定的供试液，一般需满足一条溶出曲线所有样品测定完全的时间。

示例

如：取对照品溶液，室温放置5天，分别于第0小时、4小时、8小时、24小时、2天、3天、4天、5天，照紫外-可见分光光度法（中国药典2015年版四部通则0401）在245nm波长处测定吸光度。

 

如：某缓释片溶出度利用HPLC法测定，每针运行时间为5分钟，取样点为11个点，每个点为12个样品，那么完成一条溶出曲线的测定至少需要5×11×12=660分钟，那么稳定性试验至少需要测定11小时的稳定性。

 

回收率实验

对于溶出度，范围规定为限度的±20％（回收率高、中、低常设为50％、限度浓度、100％）。

如果限度为80%，那三个点是50%、80%、100%还是60%、80%、100%？根据实验的便利性来就好了。

对于缓控释制剂，该限度照样适用。如盐酸氨溴索缓释胶囊溶出度限度为第1小时：15%~45%，则回收率最低点应为15%的±20％。

回收率试验方法1

取对照品适量，依法配制成相当于标示量50%、限度和100%的供试品溶液，均加入处方量的辅料（包括胶囊壳），必要时超声使主成分溶解，每个浓度平行配制3份，依法测定含量。

 

规定：3个浓度的平均回收率均为98.0%~102.0%；RSD≤2.0%（n=9）。

该方法只能说明方法测定的准确度良好，不能说明将样品加入溶出仪中，溶出后的溶液的测定准确度是良好的。所以就有了方法2.

回收率试验方法2

称取对照品（按标示量）6份，分别投入6个溶出杯中，每个溶出杯中均已加入不含主药的辅料（1粒/片量），按溶出度测定方法测定，计算溶出回收率。

 

规定：6个样品的平均回收率均为98.0%~102.0%；RSD≤2.0%（n=6）。

             

耐用性

很多分析实验猿们会问：

如果制定的溶出方法与含量测定方法均为HPLC法，且色谱条件一致，共用一套耐用性数据可以吗？

答案很明确，不可以！

 

因为即使色谱条件一致，也会存在样品浓度和溶媒的不同，因此仍旧需要考察耐用性。

 

试验设计同含量测定，需要考察柱温、流速、波长、色谱柱、流动相中有机相与水相比例及水相浓度和pH值。对于使用UV法测定的溶出度，照样需要考察耐用性，如波长、溶出介质浓度等。

 

最重要一点：不管为了与QC完美对接，还是和厂家妥善交接，都需要验证不同品牌溶出仪之间的耐用性。

 

小结

 

最后，落到咱们最初讨论过的那个问题，不同介质的方法学验证要验证哪些内容？

 

很不幸的说，专属性、线性和范围、精密度、稳定性、回收率、耐用性全部都要验证。。。。。。

 

例如：参照中国药典2015版二部厄贝沙坦胶囊溶出度项下条件采用的溶出介质为：0.1mol/L盐酸溶液，但是溶出曲线比对分别考察了水、pH4.5醋酸盐缓冲液和pH6.8磷酸盐缓冲液，那么溶出方法学验证需要分别考察在这4种介质（0.1mol/L盐酸溶液、水、pH4.5醋酸盐缓冲液、pH6.8磷酸盐缓冲液）中的专属性、线性和范围、精密度、稳定性、回收率、耐用性。

 

希望大家将溶出方法学验证方法烂熟于心，合理安排，减少出错。